季彩宏

關(guān)鍵詞：植物內(nèi)生菌;氧化酶;水解酶;生物堿

農(nóng)藥的合成和使用能大幅度提高農(nóng)作物產(chǎn)量，合理施用農(nóng)藥已成為調(diào)節(jié)農(nóng)作物生長(zhǎng)、防治植物病蟲害、除雜草、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)機(jī)械化和獲取高質(zhì)量農(nóng)產(chǎn)品的重要措施和保障。然而，農(nóng)藥殘留污染現(xiàn)狀不容樂觀，產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)也較大，大量農(nóng)藥沉積在土壤中，污染水源和大氣，對(duì)環(huán)境造成巨大破壞。我國(guó)的農(nóng)藥事業(yè)存在以下弊端：（1）有機(jī)合成物的結(jié)構(gòu)和品種不合理;（2）使用方法和劑量不太恰當(dāng);（3）農(nóng)藥殘留檢測(cè)和監(jiān)管不嚴(yán)。因此，農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量不斷下降，農(nóng)產(chǎn)品中的有毒、有害物質(zhì)殘留問題日益嚴(yán)重，特別是蔬菜、水果中的農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題突出。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，食品安全問題越來越受關(guān)注。近年來，越來越多的人研究植物體內(nèi)源物質(zhì)對(duì)農(nóng)藥的代謝作用，試圖找到有效的方法解決農(nóng)藥在果蔬中的殘留問題。

1 農(nóng)藥降解技術(shù)研究現(xiàn)狀

面對(duì)日益增長(zhǎng)的人口和不斷擴(kuò)大的糧食缺口，化學(xué)農(nóng)藥是防治病蟲害的有效手段。目前，國(guó)內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留問題日益突出，可通過物理、化學(xué)、生物等方法降低農(nóng)作物中的農(nóng)藥殘留量。其中，物理方法主要包括超聲波法、吸附法、洗滌法、輻照法，化學(xué)方法主要包括水解、氧化分解、光催化降解，生物方法主要包括微生物降解、降解酶、工程菌等。總體看來，物理和化學(xué)方法對(duì)高濃度農(nóng)殘的降解效果顯著，經(jīng)濟(jì)方便，但對(duì)低濃度農(nóng)殘的處理效果并不顯著。之后發(fā)展起來的生物降解方法，同樣存在技術(shù)上沒能攻克的難題，比如產(chǎn)品不穩(wěn)定、新型降解生物難尋以及成本過高等問題。因此，專家們?cè)诓粩嗵剿餍Ч@著、徹底、經(jīng)濟(jì)方便的農(nóng)藥降解方法。有研究者發(fā)現(xiàn)，加速農(nóng)藥在植物體內(nèi)的降解是降低農(nóng)藥殘留量的一個(gè)有效途徑。近年來，人們開始研究農(nóng)作物植株體內(nèi)生物降解。農(nóng)藥在生物體內(nèi)通過溶解、酶降解和細(xì)胞吞噬等作用改變農(nóng)藥化學(xué)結(jié)構(gòu)，并在生物體代謝活動(dòng)中不斷排出體外，修復(fù)后的農(nóng)藥毒性大大降低甚至極少殘留在生物體內(nèi)。因此，生物降解具有環(huán)境友好、二次污染小、見效快等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)作物農(nóng)藥殘留的降解方面具有較大的潛力。

2 農(nóng)藥在植物體內(nèi)的代謝

植物受到外源化學(xué)物質(zhì)刺激時(shí)，會(huì)進(jìn)化形成一套解毒機(jī)制，能轉(zhuǎn)化、分解體內(nèi)或殘留在表面的農(nóng)藥等外源化學(xué)物質(zhì)。近年來，對(duì)植物和除草劑的代謝與抗性關(guān)系已有大量研究，發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥在植物中代謝解毒的主要途徑是植物體內(nèi)的酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)。代謝轉(zhuǎn)化主要分為3個(gè)階段。第一階段也稱Ⅰ相代謝，農(nóng)藥在植物體內(nèi)受到水解酶、氧化酶（P450、PPO）、還原酶的作用發(fā)生水解、氧化、還原等催化反應(yīng)。反應(yīng)一般將農(nóng)藥化合物轉(zhuǎn)化成水溶性更強(qiáng)、植物毒性更低的化合物，但一些除草劑除外，它們?cè)谥参矬w內(nèi)代謝生成植物毒性更強(qiáng)的物質(zhì)。第二階段也稱Ⅱ相代謝，與Ⅰ相代謝不一樣的是，參與的降解酶包括丙二?；D(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等[1]。Ⅱ相代謝物通常比底物的水溶性更強(qiáng)、植物毒性更低，可儲(chǔ)存在液泡等細(xì)胞器中。第三階段也稱Ⅲ相代謝，主要是代謝物的運(yùn)輸轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過三磷酸腺苷（ATP）依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC從細(xì)胞液中搬運(yùn)第二階段產(chǎn)生的分解代謝物，運(yùn)輸至液泡中臨時(shí)儲(chǔ)存或再發(fā)生代謝分解;一些代謝產(chǎn)物被運(yùn)輸?shù)街参锛?xì)胞其他區(qū)域，如聚合成細(xì)胞壁組分，形成不溶性結(jié)合殘留[2]。

3 植物體內(nèi)源物質(zhì)種類對(duì)農(nóng)藥降解的影響

3.1 植物內(nèi)生菌降解農(nóng)藥的研究

植物內(nèi)生菌是一定階段或全部階段生活在健康植物組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，普遍存在于高等植物中，無論是單子葉植物、木本植物、雙子葉植物，還是草本植物，均有內(nèi)生菌，已成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌，可作為潛在的生防載體菌。不能被根際細(xì)菌降解的農(nóng)藥可能會(huì)在植物維管束中積累，某些特定的植物內(nèi)生菌在維管束中可有效降解累積的有毒化合物，削弱土壤中農(nóng)藥殘留對(duì)植物的毒害作用。植物可通過此方法進(jìn)行自我修復(fù)，對(duì)農(nóng)藥等污染物有一定的耐受性。內(nèi)生假單胞菌能降解有機(jī)氯除草劑和2，4-D。Germaine等[3]將內(nèi)生假單胞菌接種到豆科植物中，用2，4-D處理，也就是將接種的植物暴露在2，4-D環(huán)境中時(shí)，該植物組織不積累2，4-D且不受毒性影響，但是不接種的植物都積累了高濃度的2，4-D并產(chǎn)生中毒跡象，表現(xiàn)為生物量減少、根部愈傷組織發(fā)展和葉子脫落。在他們的試驗(yàn)中，還檢測(cè)到了大量根際種群，可能是加強(qiáng)土壤中2，4-D降解的原因所在。Aken等[4]也分離出了來自雜和白楊樹的植物共生菌株—甲基桿菌（Methylobacterium），能降解多數(shù)硝基化合物，例如TNT。在自然內(nèi)生菌缺乏降解能力的情況下，專家們可構(gòu)建基因工程菌，特制某種理想的菌株。Lodewyckx等[5]證實(shí)了通過基因工程構(gòu)建的抗鎳羽扇豆內(nèi)生菌，能增加鎳的積聚并與接種的植物共生。

3.2 植物體內(nèi)源酶對(duì)農(nóng)藥降解的影響

植物體內(nèi)的農(nóng)藥可被各種特異性酶吸收、轉(zhuǎn)導(dǎo)、軛合、降解和排泄等，常見的降解酶有氧化還原酶系和水解酶系;植物表面的農(nóng)藥可隨雨水沖洗進(jìn)入水體和土壤。

3.2.1 植物氧化還原酶系

3.2.1.1 細(xì)胞色素P450

細(xì)胞色素P450大量存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌和絲狀真菌等生物中，屬于血紅素-硫醇鹽蛋白的超家族，不僅能催化一些具有重要生理功能的內(nèi)源性物質(zhì)，如激素、脂肪酸、萜類化合物等的合成代謝，還參與催化氧化藥物、環(huán)境化合物等其他外源性物質(zhì)的代謝。在細(xì)胞中，細(xì)胞色素P450主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，作為一種末端加氧酶，參與生物體內(nèi)的甾醇類激素合成等過程。其催化反應(yīng)是激活一個(gè)氧分子，并將其中的一個(gè)分子氧插入底物，還原另一個(gè)分子氧，從而形成水分子。最早發(fā)現(xiàn)從菊芋和大豆中分離的CYP71A10和CYP76B1是具有除草劑代謝活性的植物細(xì)胞色素P450酶系，這兩種細(xì)胞色素P450酶系均對(duì)取代脲類除草劑有氧化代謝作用[6]。自Frear等[7]在1969年首次報(bào)道多功能氧化酶在棉花幼苗微粒體中對(duì)滅草隆具有代謝降解作用以來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種植物細(xì)胞色素P450參與農(nóng)藥代謝和降解。目前已報(bào)道玉米、大豆和高粱線粒體中的P450對(duì)滅草松有降解作用[8]。Inui等[9]研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)CYP2C19基因（P450酶系）的土豆通過脫甲基化作用和催化硫代氨基甲酸酯鍵的裂解作用代謝降解稗草畏，高粱P450酶系可催化除草劑二嗪農(nóng)P=S脫硫化為P=O類似物[10]。細(xì)胞色素P450不僅有氧化作用，還對(duì)底物有專一性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，P450氧化功能的發(fā)揮必須與一系列相關(guān)蛋白組成的多酶復(fù)合體系共同作用。該體系是由P450、細(xì)胞色素b、黃素蛋白、NADPH-P450還原酶和磷脂等組成的多酶電子傳遞體系，只有該多酶復(fù)合體系共同參與體內(nèi)氧化反應(yīng)，才能發(fā)揮氧化功能。

3.2.1.2 過氧化物酶（POD）

過氧化物酶大多存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中，是由微生物或植物產(chǎn)生的一類氧化還原酶，能催化多種反應(yīng)。過氧化物酶體是比較活躍的細(xì)胞器，能降解脂肪酸等脂質(zhì)，并清除不同的活性氧自由基。過氧化物酶體的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持細(xì)胞的氧化還原平衡至關(guān)重要，主要由ROS、過氧化物酶體蛋白酶及自噬過程調(diào)節(jié)，以鐵卟啉為輔基，以過氧化氫氧化酶為電子受體催化底物，可催化過氧化氫、胺類和酚類等化合物，能降低過氧化氫、酚類和胺類的毒性[11]。

3.2.1.3 多酚氧化酶（PPO）

多酚氧化酶是一類金屬結(jié)合酶，在植物體的各種器官或組織中普遍存在，如葉片、花器、塊莖、分生組織和根等，一般在幼嫩部位含量高，而成熟部位含量較低。多酚氧化酶是末端氧化酶類，可將電子直接傳遞給分子氧。多酚氧化酶可分為三大類：酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶。其中，漆酶和酪氨酸酶是微生物中的多酚氧化酶，兒茶酚酶主要分布在植物中，可通過氧化、還原、脫氫及水解等方式降解農(nóng)藥。漆酶對(duì)氧化酚類或芳胺類等多種底物起催化氧化作用，在催化反應(yīng)過程中，以氧氣為電子受體，發(fā)生單電子反應(yīng)，不需過氧化氫。底物被提取一個(gè)電子形成不穩(wěn)定的自由基，再經(jīng)水合、歧化、聚合等反應(yīng)形成氧化產(chǎn)物。近年來，有研究者把多酚氧化酶用于土壤環(huán)境修復(fù)等相關(guān)領(lǐng)域。丁克強(qiáng)等[12]利用土壤多酚氧化酶的反應(yīng)機(jī)制，研究了黑麥草對(duì)污染土壤的修復(fù)作用。漆酶對(duì)含酚廢水的處理、環(huán)境中酚類毒物的降解也有相關(guān)研究，印證了多酚氧化酶對(duì)農(nóng)藥的降解作用。

3.2.2 植物水解酶系

水解反應(yīng)是由水解酶催化的反應(yīng)，是農(nóng)藥在植物體內(nèi)降解的重要途徑。含有酰胺類、氨基甲酸酯類或酯鍵的農(nóng)藥，在水解酶的催化作用下裂解成兩個(gè)小分子。據(jù)報(bào)道，有機(jī)磷類農(nóng)藥主要通過水解反應(yīng)生成毒性更低的化合物。有報(bào)道稱植物的酰胺水解酶可將除草劑敵稗快速水解，使其失去殺草活性。在抗性水稻葉子中，該酶的活性比感性植株高60倍。在感性野麥體內(nèi)，新燕靈很快被水解成新燕靈酸，在抗性小麥體內(nèi)沒有這一現(xiàn)象。因此，水解作用是植物體耐某些除草劑的主要機(jī)制。對(duì)于不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物種類，農(nóng)藥水解的程度也不一樣，如溴苯腈和碘苯腈上未受阻礙的氰基能在植物體內(nèi)緩慢水解，生成的苯甲酸類產(chǎn)物對(duì)植物的毒性比親體化合物低20倍;西維因在哺乳動(dòng)物血清酯酶的作用下水解生成1-萘酚[13];氨基甲酸酯類殺蟲劑可被水解生成酚、甲胺及二氧化碳等。

3.3 生物堿植物生物堿是指

植物在長(zhǎng)時(shí)間適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的過程中，為抵抗逆境而形成的一大類堿性含氮雜環(huán)化合物，大多有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氮素多包含在環(huán)內(nèi)，有顯著的生物活性和光學(xué)活性。有些不含堿性而源于植物的含氮有機(jī)化合物有明顯的生物活性，因此仍屬于生物堿范疇。生物堿具有嚴(yán)格的組織和環(huán)境因子特異性，是植物的信使和生產(chǎn)化學(xué)物質(zhì)的工廠。生物堿是植物自身防御與病蟲草適應(yīng)外源性刺激形成的一類次生代謝產(chǎn)物，具有低毒、高效、選擇性高、不污染環(huán)境、對(duì)有益生物無害、害蟲不容易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。

植物內(nèi)源物質(zhì)對(duì)農(nóng)藥的降解過程復(fù)雜，同一種農(nóng)藥在生物體內(nèi)也有不同的代謝路徑，所以，植物內(nèi)源物質(zhì)對(duì)農(nóng)殘降解的影響研究還有很大的空間。對(duì)不同農(nóng)藥在植物中代謝轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因鑒定、關(guān)鍵控制酶、調(diào)控機(jī)制及應(yīng)用技術(shù)等均有較大的研究空間。