楊美麗，張少杰，楊金蕊，杜冬勤，王 楠

（河北省保定市食品藥品檢驗所，河北 保定 071000）

中藥復方制劑具有多藥味、多靶點的特點，中藥特征/指紋圖譜能較全面地反映中藥所含化學成分的種類與數(shù)量，是評價中藥復方制劑整體質(zhì)量的有效手段［1］。將中藥特征/指紋圖譜技術與多指標成分定量分析相結(jié)合，可同時達到控制復方制劑中主要藥味含量的目的［2］。非標準檢驗方法可考察藥品生產(chǎn)過程中違反《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）要求的情況，如不按標準投料、替代投料等，是檢驗及評價藥品質(zhì)量非常重要的技術手段。銀翹解毒丸（蜜丸）源自清代醫(yī)學家吳瑭所著《溫病條辨》中的銀翹散，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥（穗）、桔梗、牛蒡子等9 味藥材組方，具有疏風解表、清熱解毒功效，現(xiàn)行標準收載于原中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會1990年頒布的《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑（第十九冊）》，檢驗項目僅有性狀、鑒別和檢查項［3］，可控性較差，亟待提高。目前，關于銀翹解毒丸質(zhì)量控制的研究主要集中在綠原酸、連翹苷等1 種或幾種成分的含量測定或特征圖譜上［4-8］。本研究中參考文獻［9-11］，首先建立了銀翹解毒丸的指紋圖譜及多成分同時定量分析的方法，進行了相似度評價及聚類分析，建立了測定綠原酸、連翹酯苷A、牛蒡苷3 種指標性成分含量的方法，并對收集的26 批次樣品進行了整體質(zhì)量分析與評價；初步建立了山銀花替代/混合金銀花非法投料的非標準檢驗方法，可多方面考察市場上銀翹解毒丸的質(zhì)量情況。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DIONEX Ultimate 3000 型液相色譜儀［包括二極管陣列（DAD）檢測器，賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司］；SHIMADZU LC-2010A 型高效液相色譜儀［包括紫外（UV）檢測器，日本島津公司］；Waters e2695-2424型高效液相色譜儀［包括蒸發(fā)光散射（ELSD）檢測器，美國沃特世科技有限公司］；Sartorius CPA 225D 型電子天平（德國賽多利斯集團，精度為萬分之一/十萬分之一）；SK7200H 型超聲波清洗器（功率為350 W，頻率為53 kHz，上?？茖С晝x器有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號為110753-201716，含量以99.3%計），牛蒡苷對照品（批號為110819-201611，含量以95.9% 計），甘草苷對照品（批號為111610-201607，含量以100.0% 計），連翹苷對照品（批號為110821-201615，含量以94.9%計），連翹酯苷A 對照品（批號為111810-201606，含量以93.4%計），灰氈毛忍冬皂苷乙對照藥材（批號為111814-201604），川續(xù)斷皂苷乙對照藥材（批號為111813-201403），金銀花對照藥材（批號為121060-201608），連翹對照藥材（批號為120908-201216），薄荷對照藥材（批號為120916-201310），荊芥對照藥材（批號為120911-201512），淡豆豉對照藥材（批號為121594-201403），牛蒡子對照藥材（批號為120903-201510），桔梗對照藥材（批號為121028-201612），甘草對照藥材（批號為120904-201620），山銀花對照藥材（批號為121595-201202），均購自中國食品藥品檢定研究院；淡竹葉（藥都集團茗都藥業(yè)有限公司，批號為170701）；乙腈為色譜純，磷酸、甲酸、冰醋酸均為分析純，水為娃哈哈純凈水；26 批銀翹解毒丸（水蜜丸、大蜜丸各13 批）購于河北省內(nèi)各市縣，涉及省內(nèi)外生產(chǎn)企業(yè)共6 家。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜及多成分同時定量分析

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Phenomenex Luna Omega Polar C18100A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相∶乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B），按表1 程序進行梯度洗脫；流速:1.0 mL/ min；檢測波長:230 nm；柱溫:30 ℃；進樣量:10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

4. 綠原酸 6. 連翹酯苷A 13. 牛蒡苷A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖4.chlorogenic acid 6.forsythoside A 13.arctiinA.Mixed reference solution B. Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program（%）

2.1.2 溶液制備

供試品溶液:取水蜜丸（研碎）0.9 g，或大蜜丸（剪碎）1.35 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）處理30 min，放至室溫，補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

單一對照藥材溶液:取處方中各藥味的對照藥材，參照供試品溶液取樣量按處方比例取樣，按供試品溶液制備方法逐一制備對照藥材溶液。

單一對照品溶液:取綠原酸對照品、牛蒡苷對照品、連翹苷對照品、連翹酯苷A 對照品、甘草苷對照品各適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，分別制成每1 mL 含0.1 mg 的單一對照品溶液。

混合對照品溶液:取綠原酸對照品、連翹酯苷A 對照品、牛蒡苷對照品各適量，精密稱定，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為113.1，96.58，96.57 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.3 指紋圖譜方法學考察與分析

精密度試驗:取同一供試品溶液10 μL，按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定特征峰15 個。結(jié)果以峰面積較大、分離度較好的13 號峰（保留時間約為30.3 min）為參照峰，1 ～15 號峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于1.00%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件分別于0，2，4，6，8，12，24 h 時連續(xù)進樣7 次。結(jié)果以13 號峰為參照峰，1 ～15 號峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于1.80%（n ＝7），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一批（批號為17033705）樣品7 份，依法制備供試品溶液，并進樣測定。結(jié)果以13 號峰為參照峰，1 ～15 號峰的相對保留時間和相對峰面積含量的RSD 均小于1.00%（n ＝7），表明方法重復性良好。

特征峰指認及歸屬:分別取單一對照品溶液進樣測定，比較色譜峰的保留時間及紫外光譜結(jié)果，結(jié)果樣品指紋圖譜中峰4 為綠原酸，峰6 為連翹酯苷A，峰8 為甘草苷，峰12 為連翹苷，峰13 為牛蒡苷，詳見圖2。將制備的單一對照藥材溶液分別進樣分析，與樣品色譜峰的保留時間及紫外光譜比較，結(jié)果峰2，3，4 屬金銀花，峰1，6，9，12 屬連翹，峰7，8 屬甘草，峰13屬牛蒡子。

圖2 指紋圖譜特征峰指認Fig.2 Identification of characteristic peaks in fingerprint

指紋圖譜測定及相似度評價:對26 批樣品進行指紋圖譜測定，以13 號峰（牛蒡苷）為參照峰，各峰相對保留時間的RSD 均小于5.00%。采用國家藥典委員會主持開發(fā)的中藥指紋圖譜相似度評價軟件生成標準譜圖，分別對26 批樣品與標準譜圖進行多點校正、Mark 峰匹配并計算相似度。匹配譜圖見圖3，相似度見表2。

圖3 銀翹解毒丸（部分示例）與標準譜圖Mark 峰匹配圖Fig.3 Matching diagram of Yinqiao Jiedu Pills（some examples）with Mark peak of standard spectrogram

表2 銀翹解毒丸相似度計算結(jié)果Tab.2 Similarity of Yinqiao Jiedu Pills

聚類分析:采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件中系統(tǒng)聚類法的Ward 法，選取平方Euclidean 距離為度量標準，對所測樣品與標準譜圖的相似度進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果按相似度大小將樣品分為3 類。1）相似度為0.95 以上的有16 批樣品，其綠原酸、連翹酯苷A、牛蒡苷含量均非常高，尤其是連翹酯苷A 所代表的連翹歸屬的色譜峰峰高均顯著高于其他批次。2）相似度為0.90 ～0.95的無樣品。3）相似度為0.80 ～0.90 的有8 批樣品，其中0.85 ～0.90 的有5 批樣品，與標準譜圖比較，其主要差異為連翹相關成分含量相對偏低，經(jīng)與同廠樣品（相似度在0.95 以上）對照分析，結(jié)合連翹采收期認為，青翹、老翹均可對連翹投料造成同廠、不同批次成藥間的差異，而有研究證實兩者的連翹酯苷A、連翹苷等成分確實存在較大差異［12］；相似度為0.80 ～0.85 的有3 批樣品（編號為18，19，20），其連翹相關成分含量同樣偏低，但經(jīng)其他研究證實其存在山銀花替代/混合金銀花投料的情況；聚類分析將相似度為0.80 ～0.90 的樣品聚為一類，能分析出使用老翹投料的樣品，但由于山銀花及金銀花在紫外檢測條件下的譜圖差異小，成分差異不明顯，因此聚類未能再細化，但0.85 的限度也基本能將銀翹解毒丸的真?zhèn)蝺?yōu)劣區(qū)分開來。4）相似度為0.80 以下的有2 批樣品（編號為16，17），圖譜中顯示綠原酸和牛蒡苷含量極低，存在不按處方投料、以次充好投料等嫌疑。因此，指紋圖譜相似度在0.85 以下的樣品均可視為樣品質(zhì)量存疑。詳見圖4 和表3。

2.1.4 多成分定量分析

線性關系考察:分別精密量取綠原酸對照品溶液（113.1 μg/mL）1 mL 和3 mL，置10 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別取5 μL 和10 μL及稀釋前綠原酸對照品溶液5，10，15 μL，進樣分析。精密量取連翹酯苷A 對照品溶液（96.58 μg/mL）3 mL，置10 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別取3，5，10 μL 及稀釋前連翹酯苷A 對照品溶液（96.58 μg/mL）5，10，15 μL，進樣分析。精密量取牛蒡苷對照品溶液（96.57 μg/mL）1 mL，置10 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別取5，10，20 μL 及稀釋前牛蒡苷對照品溶液（96.57 μg/mL）5，10，15 μL，進樣分析。均以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得各成分的回歸方程，結(jié)果各化合物在相應進樣量范圍內(nèi)線性關系良好。同時，分別測得3 個化合物的檢測限（S/ N ＝3）與定量限（S/ N ＝10）。詳見表4。

圖4 指紋圖譜相似度聚類分析Fig.4 Cluster analysis of fingerprint similarity

表3 銀翹解毒丸聚類分析結(jié)果Tab.3 Cluster analysis of Yinqiao Jiedu Pills

表4 3 個成分的線性關系、檢測限和定量限考察結(jié)果Tab.4 The results of linear relationship，limit of detection and limit of quantitation of three compounds

精密度試驗:精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6 次。結(jié)果綠原酸、連翹酯苷A、牛蒡苷峰面積的RSD分別為0.65%，0.79%，0.35%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件分別于0，1，2，4，6，8，12，24 h 時進樣測定。結(jié)果綠原酸、連翹酯苷A、牛蒡苷峰面積的RSD 分別為0.25%，0.50%，0.25%（n ＝8），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一批（批號為17033705）樣品7份，依法制備供試品溶液，并依法測定。結(jié)果綠原酸、連翹酯苷A、牛蒡苷的平均含量分別為2.743 4，2.526 3，3.651 4 mg/g（n ＝7），RSD 分 別 為1.02% ，1.39% ，0.73%（n ＝7），表明方法重復性良好。

專屬性試驗:用單一對照藥材溶液、對照品溶液模擬試驗，考察陰性樣品在待測成分處有無干擾。色譜圖見圖5。結(jié)果表明，金銀花及牛蒡子中均含有綠原酸，金銀花中含量較高；牛蒡苷只存在于牛蒡子中，連翹酯苷A 只存在于連翹中，其他藥味在綠原酸、牛蒡苷、連翹酯苷A 相應位置上無干擾，即陰性樣品溶液在待測成分處均無干擾。

圖5 單一對照藥材溶液及對照品溶液高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of single reference material solution and reference solution

加樣回收試驗:取樣品粉末8 份，每份0.45 g，精密稱定，按樣品含量的100.00%分別加入綠原酸對照品、連翹酯苷A 對照品、牛蒡苷對照品，依法制備供試品溶液，進樣10 μL，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果見表5。

樣品含量測定及分析:取26 批樣品，依法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算樣品中綠原酸、連翹酯苷A、牛蒡苷的含量。結(jié)果見表6?？梢姡煌a(chǎn)廠家的綠原酸及牛蒡苷含量基本無差異，但編號為16，17 的樣品（山西某公司生產(chǎn)的大蜜丸）的綠原酸及牛蒡苷含量極低；連翹酯苷A 的含量為每袋14.4 ～45.6 mg 或每丸4.5 ～46.8 mg（因劑型不同，每袋或每丸均為1 次口服劑量，相當于原藥材的量相同），差異較大，其中編號為18，19，20 的3 批樣品的含量最低。上述26 批樣品按現(xiàn)行藥品標準檢驗均合格，但按本研究中含量測定方法檢驗，發(fā)現(xiàn)5 批樣品（編號為16，17，18，19，20）明顯存在質(zhì)量問題，與指紋圖譜相似度分析結(jié)果一致，相似度均低于0.85，質(zhì)量存疑。

表5 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝8）Tab.5 Results of recovery tests（n ＝8）

表6 樣品含量測定結(jié)果（mg）Tab.6 Results of content determination of samples（mg）

2.2 山銀花替代/混合金銀花投料非標準檢驗方法與結(jié)果

色譜條件:色譜柱為Waters Sunfire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；流動相為乙腈（A）-0.4%醋酸（B），梯度洗脫程序見表7；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。

表7 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.7 Gradient elution program of mobile phase（%）

Waters 2424 ELSD 檢測器參數(shù):漂移管溫度為60 ℃；動力級別為60%；增益值為150；壓力為35 psi。

溶液制備:取1 袋/丸樣品，粉碎或剪碎，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇溶液30 mL，超聲（功率為300 W，頻率為53 kHz）處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL 使溶解，用水飽和正丁醇萃取2 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液30 mL 洗滌1 次，將正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇10 mL 使溶解，作為供試品溶液。取除金銀花外的其他對照藥材組成1 次口服劑量的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備陰性對照樣品溶液。另取金銀花及山銀花適量，同法制備金銀花對照藥材溶液及山銀花對照藥材溶液。

專屬性考察:灰氈毛忍冬皂苷乙及川續(xù)斷皂苷乙是山銀花區(qū)別于金銀花的主要成分［13-15］。本研究中發(fā)現(xiàn)，陰性樣品在川續(xù)斷皂苷乙色譜峰位置無干擾，而山銀花特征色譜峰明顯，金銀花于此色譜條件下幾乎無響應。若山銀花替代金銀花投料，可明顯檢查出色譜峰，故確定了川續(xù)斷皂苷乙作為特征性成分檢查山銀花的依據(jù)。色譜圖見圖6。

樣品山銀花測定:26 批樣品中，水蜜丸有13 批，按上述檢查方法均未檢出川續(xù)斷皂苷乙；大蜜丸有13 批，3 批檢出陽性，且色譜峰非常明顯，陽性檢出率為11.54%，表明確實存在部分企業(yè)違反GMP 相關規(guī)定，不按標準投料、替代/混合投料的情況。色譜圖見圖7。

3 討論

3.1 標準檢驗情況

銀翹解毒丸現(xiàn)行藥品標準有性狀、鑒別、檢查項，26批樣品經(jīng)標準檢驗全部合格。由于鑒別項僅定性不定量，不同廠家不同批號樣品的顯微及薄層色譜鑒別圖譜雖存在一定差異，質(zhì)量參差不齊，但均滿足檢出要求，故標準檢驗結(jié)果全部合格。

3.2 指紋圖譜及多成分同時定量分析及質(zhì)量評價

銀翹解毒丸由9 味藥材組方，金銀花、連翹為君藥，荊芥、薄荷、淡豆豉為醫(yī)藥，牛蒡子、桔梗、甘草、淡竹葉為佐藥，甘草調(diào)和諸藥，為使藥［16］。9 味藥中，荊芥、薄荷含揮發(fā)性成分，宜采用氣相色譜法分析；桔梗因其成分結(jié)構特征，宜采用HPLC-ELSD 法分析；金銀花、連翹、牛蒡子、甘草等均在指紋圖譜（采用HPLC-DAD 法）中良好呈現(xiàn)，選取圖中分離度好、含量高且具有藥味代表性的成分進行定量測定，以期同時定性定量測定，合理評價該藥。

圖6 專屬性考察高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms for specificity test

圖7 部分樣品山銀花測定高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms for determination of Lonicerae Flos in some samples

指紋圖譜測定及相似度評價分析中，篩查出5 批樣品相似度低于0.85，質(zhì)量存疑。結(jié)果顯示，有2 批（編號為16，17）綠原酸及牛蒡苷含量極低，有3 批（編號為18，19，20）連翹酯苷A 含量極低，質(zhì)量存疑。指紋圖譜與含量測定分別篩查出的5 批能一一對應，顯示方法具有相關性。26 批樣品標準檢驗合格率為100.00%，按該方法檢驗質(zhì)量存疑率為19.23%，樣品存在不按處方投料、以次充好投料等嫌疑。

2015年版《中國藥典（一部）》規(guī)定連翹采收期不同，有青翹、老翹之分，但方劑入藥無指導說明，而兩者在成分含量上有顯著差異，連翹酯苷A 在6月下旬到7月下旬采收含量最高，8月采收有所下降，但幅度不大，9月采收下降幅度較大［17］。指紋圖譜分析中，同為北京同某堂銀翹解毒丸，相似度高于0.95 的批次中連翹的相關成分顯著高于相似度為0.85 ～0.90 的批次，分析認為前者為青翹投料，后者為老翹投料。由于沒有相關指導原則，廠家隨意投料，易造成不同批次藥效變化及治療效果的波動，建議有關部門進行相關考察，對二者制訂不同的質(zhì)量標準，并開展藥理學、藥效學差異等方面的研究工作，以便正確指導生產(chǎn)及臨床應用。

3.3 非標準檢驗方法篩查情況

2005年版至2015年版《中國藥典（一部）》中山銀花的性味、歸經(jīng)、功能主治、用法用量與金銀花完全相同，但由于其價格低廉，又有使用合法的歷史，在外觀性狀上與忍冬（金銀花的一個主要來源）也較相似，則部分企業(yè)違規(guī)將其替代/混合金銀花使用。該行為違反了GMP 相關規(guī)定，擾亂了市場秩序，造成了不正當競爭，應嚴厲打擊。26 批樣品中，有3 批檢出山銀花陽性，說明實際生產(chǎn)中確實存在部分企業(yè)違反GMP 相關規(guī)定，不按標準投料，不按規(guī)定生產(chǎn)，須嚴厲打擊。本研究中目前進行了初步篩查，后續(xù)會繼續(xù)完善檢查方法，堅決打擊藥品生產(chǎn)過程中的違法、違規(guī)現(xiàn)象。

3.4 方法評價

本研究結(jié)果顯示，在現(xiàn)行標準基礎上建立的指紋圖譜及多指標性成分含量同時測定的方法，有效補充了標準方法的漏洞，一次測定可多方面分析藥品，可體現(xiàn)藥品的真實性，綜合評價藥物整體質(zhì)量。初步建立的山銀花替代/混合金銀花投料的非標準檢查方法，可有效篩查出不按標準投料、違反GMP 要求生產(chǎn)的藥品。本研究中建立的方法對規(guī)范生產(chǎn)及對銀翹解毒丸的質(zhì)量控制均能提供有效的技術支持。