洪小瑜 戴亞麗 林秋訊 莊常水 韓令川 盧東暉 劉虹麗 薛冬梅 謝 謙 林 遠(yuǎn)

1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科 (廣東 深圳 518036)

2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院干部保健科 (廣東 深圳 518036)

3.北京大學(xué)深圳醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 (廣東 深圳 518036)

隨著人們生活水平的提高，2型糖尿病的發(fā)病率正逐年上升[1-2]。我國糖尿病患者位居世界第一，來自于滕衛(wèi)平教授牽頭的流行病學(xué)調(diào)查顯示我國糖尿病病人共1.298億，患病率達(dá)11.2%[3]。糖尿病嚴(yán)重威脅人類生存和健康，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來很多研究發(fā)現(xiàn)人類的“第二基因組”—腸道菌群，與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]，某些降糖藥可改善糖尿病患者的腸道菌群[5-6]。作為糖尿病治療的“五駕馬車”之一，生活方式的管理(飲食+運(yùn)動)是2型糖尿病的基礎(chǔ)治療，而生活方式的管理對糖尿病患者腸道菌群的影響如何？相關(guān)研究較少。本研究采用生活方式的管理對新診斷2型糖尿病患者腸道菌群的影響進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究采用自身前后對照方法，選取2018年2月至2019年7月就診于北京大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科的新診斷的2型糖尿病患者30例(入組34例，脫落4例)，年齡24～65歲，平均年齡50±10.87歲，其中男19例，女15例。研究方案經(jīng)北京大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會通過。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 2型糖尿病疾病診斷參照1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病專家委員會制定標(biāo)準(zhǔn)，新診斷的2型糖尿病患者(病程≤1年)，男女均可；年齡：≥20歲且≤70歲；體重指數(shù)在(19.0～35.0)kg/m2范圍內(nèi)；未使用藥物控制血糖，篩選期糖化血紅蛋白(HbA1C%) ≥6.5%且≤10.0%，同時(shí)篩選當(dāng)日空腹血糖值≤11.1mmol/L。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)重肝腎功能障礙[ALT大于正常上限的3.0倍，或eGFR＜30mL/(min·1.73m2)]、精神病、伴有嚴(yán)重感染、重度貧血、中性粒細(xì)胞減低癥；其他嚴(yán)重器質(zhì)性心臟病，如先天性心臟病等；患有1型糖尿病、單基因突變糖尿病、由胰腺損傷引起的糖尿病或其他繼發(fā)性糖尿??；曾經(jīng)或現(xiàn)在使用口服降糖藥或胰島素或腸促胰素類藥物控制糖尿??；過去1月內(nèi)服用了益生菌或益生元產(chǎn)品；過去3月內(nèi)出現(xiàn)糖尿病酮癥酸中毒或糖尿病高滲狀態(tài)等糖尿病急性并發(fā)癥；過去5年內(nèi)有已進(jìn)行治療或未進(jìn)行治療的器官系統(tǒng)腫瘤，無論是否有局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的證據(jù)；有活性物質(zhì)濫用史，包括酒精和過去2年內(nèi)有與酒精相關(guān)的病史；受試者現(xiàn)患有引起各種急慢性腹瀉和嚴(yán)重便秘的消化道疾病；既往有腸段切除手術(shù)史，或一年之內(nèi)接受過其他消化道手術(shù)史，或半年內(nèi)接受其他非消化道手術(shù)史；過去3個(gè)月內(nèi)使用了控制體重的藥物(包括減肥藥)、皮質(zhì)類固醇等激素類藥物的口服、肌注或靜脈全身性給藥、非消化道給藥或關(guān)節(jié)內(nèi)給藥；妊娠或計(jì)劃妊娠者；3月內(nèi)參加過其它藥物的臨床試驗(yàn)。

1.2 研究方法

1.2.1 入組 符合入組條件者，均簽署知情同意書，完成體格檢查(測量身高、體重、血壓、脈搏、呼吸、腰圍、臀圍)，計(jì)算BMI；抽血做生化檢測，同時(shí)留取大便標(biāo)本(見腸道菌群檢測)，完成心電圖、尿液等檢測(具體指標(biāo)及方法見生化指標(biāo))。

1.2.2 生活方式教育 進(jìn)行小班教育(在入組后1周內(nèi)完成，每班不超過5個(gè)人)，小班教育前進(jìn)行糖尿病相關(guān)知識的測試，然后以幻燈講座加糖尿病食品模型、看圖等方式重點(diǎn)講解糖尿病的飲食以及運(yùn)動，每個(gè)入組的患者需要掌握自己的血糖、HbA1C%控制目標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)體重，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)體重學(xué)會計(jì)算自己每天應(yīng)該攝入飲食的大卡，并計(jì)算出每天的碳水化合物、蛋白以及脂肪等三大營養(yǎng)食品的攝入量，合理分配正餐以及加餐；同時(shí)根據(jù)個(gè)人的情況，學(xué)會運(yùn)動的方法、運(yùn)動的時(shí)間和運(yùn)動的量(遵照2017版中國2型糖尿病防治指南)。課程結(jié)束后再次進(jìn)行測試，每個(gè)人成績達(dá)到90分以上為合格，可免費(fèi)多次聽講。

1.2.3 隨訪 患者入組后每月來院一次監(jiān)測指間血糖(包括空腹以及餐后2h)，并測體重，血壓、心率、呼吸等，詢問不良反應(yīng)并記錄。12周后進(jìn)行最后一次隨訪，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(同入組時(shí))，再次進(jìn)行75gOGTT實(shí)驗(yàn)，完成心電圖、尿液等檢測，并留取大便標(biāo)本(同入組的方法)。從入組到隨訪結(jié)束，每次完成病例隨訪(CRF)表格填寫。

1.2.4 生化指標(biāo)的測定 分別在基線及12周用全生化自動儀檢測(貝克曼庫爾特AU5800)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、HbA1C%、空腹血糖、75gOGTT兩小時(shí)血糖、空腹胰島素、75gOGTT兩小時(shí)胰島素，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(m IU/L)/22.5；完善肝功、腎功、尿酸、心肌酶、電解質(zhì)、尿微量白蛋白、尿常規(guī)等檢測。檢查當(dāng)日清晨空腹來院，由護(hù)士統(tǒng)一抽血，相關(guān)指標(biāo)檢測由我院檢驗(yàn)科統(tǒng)一完成。

1.2.5 腸道菌群檢測 (1)糞便收集與保存：采用無菌凍存管收集患者自然排泄的糞便，一般在1 0 m i n 內(nèi)完成采集。避開糞便表面，收集中心部分約5～10g，液氮速凍，-80℃條件下凍存。(2)糞便總 DNA 提取和腸道菌群宏基因組測序：使用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取腸道菌群DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為：上游引物5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'下游引物 5'-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3'，擴(kuò)增目的片段的條件為，94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，40個(gè)循環(huán)后結(jié)束。將目的片段進(jìn)行膠回收，而后將回收的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增。(以上由上海微基生物有限公司完成)。

表1 兩組間基線資料對比

圖1 B1為基線和3個(gè)月后隨訪相比的差異物種。梭桿菌(Fusobacterium)無論從門、綱、目、科、屬水平經(jīng)過3個(gè)月生活方式干預(yù)后豐度均顯示減少。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(±s) 表示，兩組間的資料對比，若符合正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn) 。若不符合正態(tài)分布，則采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化結(jié)果 由表1可知，生活方式管理前后患者的體重、HbA1C%、空腹血糖、OGTT兩小時(shí)血糖、TC、胰島素抵抗指數(shù)較前下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

2.2 腸道菌群檢測結(jié)果 alpha多樣性結(jié)果與beta多樣性結(jié)果顯示兩組沒有顯著性差異(P＞0.05)；基于物種的分析結(jié)果顯示：采用lefse的分析方法，篩選LDA值大于2且P值小于0.05的物種為兩組中的差異物種(圖1)。

3 討論

越來越多的研究表明，人體腸道菌群與肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。早期Gill、Wolf等發(fā)現(xiàn)，肥胖人群腸道內(nèi)厚壁菌屬的數(shù)量較健康人群增多明顯，Larsen等[4]研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道菌群中厚壁菌門和類梭狀芽孢桿菌數(shù)量減少?，F(xiàn)大多研究表明腸道乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的減少與糖耐量異常有著密切的關(guān)系。另有研究表明，球形梭菌亞群和柔嫩梭菌亞群的大部分細(xì)菌有利于宿主從飲食中吸收能量，導(dǎo)致肥胖、糖尿病代謝性疾病的發(fā)生率升高[7]。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者產(chǎn)丁酸菌羅斯菌和優(yōu)桿菌屬顯著降低[8]。國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)我國2型糖尿病患者腸道菌群失調(diào)，柔嫩梭菌屬、Clostridiales sp.SS3/4及羅斯菌等產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌顯著降低而大腸埃希菌等機(jī)會致病菌顯著增加[9]。新疆維吾爾族T2DM患者腸道中具核梭桿菌水平可能與該民族T2DM患者的糖脂代謝紊亂密切相關(guān)[10]。

眾所周知，糖尿病治療包括：飲食、運(yùn)動、藥物、監(jiān)測以及教育等五架馬車，而生活方式的改變(飲食+運(yùn)動)是2型糖尿病患者的基礎(chǔ)治療。糖尿病飲食可以降低機(jī)體內(nèi)胰島細(xì)胞的負(fù)荷，可更好地控制血糖[11]；運(yùn)動能提高組織對糖的利用率，改善胰島素抵抗[12]。部分研究發(fā)現(xiàn)調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)有利于2型尿病腸道菌群的改善。白鈺等[13]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)高膳食纖維低 GI(升糖指數(shù))飲食干預(yù)后，擬桿菌屬、雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量增加，可糾正 T2DM患者的腸道菌群失衡[13]。膳食纖維可促進(jìn)雙歧桿菌生長，利于腸道的菌群失衡的糾正[14]。

運(yùn)動可調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)和平衡，使有益菌群的數(shù)量和腸道菌群的豐度增加，從而降低血糖。 國外研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠運(yùn)動干預(yù)后，甲烷短桿菌、擬桿菌屬及梭菌屬的數(shù)量均發(fā)生改變，改善了腸道菌群[15]。

本研究對于新診斷的2型糖尿病患者，通過生活方式的改善(飲食+運(yùn)動)，從門、綱、目、科、屬各級均減少了新發(fā)的2型糖尿病患者梭桿菌的豐度，從臨床效果體重減輕3.4kg，空腹及餐后血糖也下降明顯，糖化血紅蛋白下降0.9%，改善了胰島素抵抗，這與文獻(xiàn)報(bào)道2型糖尿病的梭桿菌豐度增加，與降糖藥物-阿卡波糖治療達(dá)到相似的結(jié)果[11,16]。生活方式的改變可以達(dá)到較好的降糖、減重的療效，推測其機(jī)制可能與生活方式改善后，調(diào)整了飲食結(jié)構(gòu)，增加膳食纖維的攝入，控制碳水化合物的攝入量，導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生變化有關(guān)[17]。

本研究還存在以下不足：本研究僅觀察糖尿病病人生活方式改變自身前后對照，沒有設(shè)置正常人進(jìn)行對照研究。同時(shí)本研究病例樣本量不足夠大，可能會導(dǎo)致研究結(jié)果存在部分偏倚。本研究僅觀察了生活方式改變可以改善2型糖尿病患者腸道菌群，改善了臨床各指標(biāo)，但對腸道菌群改善與臨床結(jié)局改善之間的機(jī)制并未深入探討。

綜上所述，腸道菌群失調(diào)是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制之一。對于新診的2型通過生活方式管理可以改善2型糖尿病患者腸道菌群，同時(shí)減輕體重并降低患者空腹、餐后血糖以及HbA1C%，改善胰島素抵抗，是2型糖尿病患者有效的治療方法之一。