段笑笑 邴啟政 張嚴(yán)琦 王 媛 劉 倩 馬 帥 李 彥

（青島市動物疫病預(yù)防控制中心， 山東青島 266000）

副豬嗜血桿菌（Haemophihlsparasuis, HPS）為巴氏桿菌屬短小桿菌，革蘭氏染色陰性，存在于健康豬上呼吸道，特別是鼻黏膜和扁桃體區(qū)域[1]。菌株移行到肺部則引起肺炎，從而引發(fā)全身性疾病，特征性臨床癥狀為纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等，被稱為Glasser's 病[2]。副豬嗜血桿菌病在斷奶前后和保育期仔豬中多發(fā)，尤其與藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒2 型混合感染時，發(fā)病率與死亡率都較高，是給我國養(yǎng)豬業(yè)中造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失的豬疫病之一。

副豬嗜血桿菌分離較困難，死亡病例中較難分離，一般采用具有典型臨床癥狀、瀕臨死亡、未用抗生素治療的病豬，無菌采集其關(guān)節(jié)液、心包液、胸腔積液等，并將這些液體平板劃線于TSA 培養(yǎng)基上，37℃，5%CO2培養(yǎng)24～48 h，連續(xù)純化培養(yǎng)，挑取針尖大小，透明光滑的菌落進(jìn)行鏡檢、生化鑒定、PCR 和測序等對致病菌進(jìn)行鑒定，最終確定分離菌株是否為HPS。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料及菌種來源

試驗(yàn)病料來源于青島某養(yǎng)豬場一份疑似HPS 感染的病豬關(guān)節(jié)液。

1.1.2 藥品與試劑盒

TSA、TSB 培養(yǎng)基購自北京銀杏林科技開發(fā)有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；NAD、細(xì)菌生化鑒定管、藥敏紙片購自青島海博生物技術(shù)有限公司；dNTP、PCR Buffer（Mg2+）、Taq DNA 聚合酶、DL-2000 均購自TaKaRa 生物公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

TSA 培養(yǎng)基的配制：稱取TSA 培養(yǎng)基40 g ，溶解于1 000 mL 蒸餾水中，121℃滅菌20 min，冷卻至60℃左右，加入含0.005%的NAD 和5%胎牛血清，傾倒平皿至凝固，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

TSB 培養(yǎng)基的配制：稱取TSB 培養(yǎng)基30 g，溶解于1 000 mL 蒸餾水中，121℃滅菌20 min，冷卻至60℃左右，加入0.005%的NAD 和5%胎牛血清，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 其他緩沖液及試劑

滅菌生理鹽水：稱取0.9 g NaCl 溶解于100 mL 蒸餾水中，121℃滅菌15 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 主要儀器設(shè)備

HZQ-FX 全溫振蕩器，購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DXP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器公司；1010-2 型干燥箱，購自上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；DELTA320 電子pH 計(jì)，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MDF382E 超低溫冰箱，購自SANYO 公司；島津SHIMADZU 紫外可見分光光度計(jì)UV-2550，購自日本島津公司；立式壓力蒸汽滅菌器，購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；S&B FAZ14 電子天平，購自上海海康電子儀器廠；Nikon 顯微鏡，購自尼康儀器（上海）有限公司；SW-CJ 型超凈工作臺，購自濟(jì)南潔凈康凈化設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

從具有典型漿膜炎、腹膜炎、心包炎的病豬體內(nèi)，無菌采集關(guān)節(jié)液，接種于TSA 平板，并置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，連續(xù)純化培養(yǎng)。最后挑取單菌落，與生理鹽水混勻后，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察分離菌株形態(tài)。

1.2.2 生化鑒定

在超凈工作臺中，用接種環(huán)挑取針尖大小，光滑透明的單菌落接種于TSB 液體培養(yǎng)基中，180 r/min 震蕩培養(yǎng)12～16 h，吸取菌液依次加入到以下生化鑒定管中：葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、氧化酶、接觸酶、吲哚、硝酸鹽還原、尿素酶，37℃恒溫箱中培養(yǎng)，記錄生化試驗(yàn)變色情況。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì)

上游引物：5'-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3'

下游引物：5'-GTG ATG AGG AAG GGT GGTGT-3'

1.2.3.2 細(xì)菌DNA 提取

菌液直接煮沸法：取經(jīng)鏡檢無雜菌污染的HPS 菌液1 mL，于10 000 rpm/min 離心5 min，將上清倒掉，用雙蒸水溶解沉淀物，100℃煮沸15 min，12 000 rpm/min 離心5 min，收集上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌落直接PCR：將HPS 菌落直接加入PCR 反應(yīng)管中，預(yù)變性溫度為97℃，時間7 min。

1.2.3.3 擴(kuò)增基因組DNA反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件如下。如表1、表2。

表1 反應(yīng)體系

表2 反應(yīng)條件

經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 產(chǎn)物序列分析

將產(chǎn)物、引物直接送至華大基因進(jìn)行測序分析。

1.2.5 HPS 生長曲線測定

在無菌條件下，用少量TSB 培養(yǎng)基洗下固體培養(yǎng)基上的菌苔，用移液槍吸入100 mL 的TSB 培養(yǎng)基中，37℃180 r/min 震蕩培養(yǎng)，16 h 后，吸取20 μL 加入到全自動微生物生長系統(tǒng)反應(yīng)板中，加入TSB 培養(yǎng)基400 μL，連續(xù)震蕩培養(yǎng)，每隔2 h 測定600 nm 處吸光光度值，繪制HPS 生長曲線。

1.2.6 豚鼠致病性、藥物敏感性分析

將15 只豚鼠隨機(jī)分為3 組，分別為試驗(yàn)組一、試驗(yàn)組二、對照組，每組5 只。分別注射1 mL 1.0×108CFU/mL 的HPS、1 mL 1.0×109CFU／m LHPS 和l mL TSB，觀察7 d。將死亡豚鼠進(jìn)行剖檢觀察，作細(xì)菌分離、PCR 檢測。7 天后處死剩余的豚鼠，觀察豚鼠的臨床病理變化，分離細(xì)菌。

選用直徑90 mm 的平皿，密集劃線接種菌種，無菌放置7 個藥敏紙片，倒置37℃溫箱培養(yǎng)24 h，取出測量觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落及形態(tài)

關(guān)節(jié)液在TSA 培養(yǎng)基上，經(jīng)過連續(xù)分離純化，挑取具有針尖大小，表面光滑濕潤、無色透明的菌落（見圖1），與生理鹽水混勻涂片，進(jìn)行革蘭氏染色。鑒定結(jié)果為革蘭氏陰性，短桿狀（見圖2）。

圖1 菌落形態(tài)

2.2 生化鑒定結(jié)果

在超凈工作臺中，用接種環(huán)挑取針尖大小，光滑透明的單菌落接種于TSB 液體培養(yǎng)基中，180 r/min 震蕩培養(yǎng)12～16 h，吸取菌液依次加入到生化鑒定管中，試驗(yàn)結(jié)果均與HPS 標(biāo)準(zhǔn)菌株的特征相符合，菌液生化鑒定結(jié)果與接觸酶、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性，與氧化酶、尿素酶試驗(yàn)為陰性（表3）。

圖2 革蘭氏染色陰性（10×100）

2.3 PCR 結(jié)果

經(jīng)過PCR 擴(kuò)增，其產(chǎn)物為822 bp 大小的片段，與預(yù)擴(kuò)增目的片段大小一致。電泳結(jié)果見圖3 所示，1 為分離株16S rRNA 擴(kuò)增結(jié)果。

圖3 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 PCR 產(chǎn)物序列比對結(jié)果

通過與NCBI Blast 比較，該分離株序列與已發(fā)表的副豬嗜血桿菌16S rRNA 序列同源性最高，為99%，證明分離株均為副豬嗜血桿菌。

表3 HPS 生化鑒定結(jié)果

2.5 生長曲線

根據(jù)OD600測定情況，將副豬嗜血桿菌生長曲線繪制見圖4。

圖4 副豬嗜血桿菌生長曲線

HPS 生長曲線說明，接種后4 h 左右，菌液OD600值逐漸上升，在14 h 左右達(dá)到最大值，此后隨著時間的延長，OD600值基本不變。

2.6 分離株對豚鼠致病性及藥物敏感性分析

試驗(yàn)組一5 只豚鼠均未發(fā)生死亡，但精神萎靡；試驗(yàn)組二攻毒后第1 d 死亡2 只豚鼠，第2 d 死亡3 只豚鼠，剖檢可以觀察到肺臟有明顯的出血點(diǎn)，但是無其他特征性的病變，可分離到HPS；對照組無任何癥狀。一周后解剖存活的豚鼠，結(jié)果顯示，對照組無任何病變；試驗(yàn)組一的豚鼠肺臟有彌漫性出血點(diǎn)、實(shí)變、腫脹，肝臟出現(xiàn)腫脹和充血，但未見漿膜炎癥狀。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，副豬嗜血桿菌對頭孢曲松高敏感，對阿奇霉素低敏感，對其他藥物敏感。具體見表4。

3 討論

3.1 HPS 的分離

HPS 的分離一般選用瀕臨死亡的未用抗生素治療的病料，死亡病料中一般很難分離。分離從具有典型病變的肝臟、肺臟、心包液、關(guān)節(jié)液等部位進(jìn)行。從鼻腔、支氣管等部位分離的HPS 為常在菌，與致病性無關(guān)。本研究分離的菌株在細(xì)菌形態(tài)、生化鑒定、PCR 等都符合HPS 的標(biāo)準(zhǔn)，可確定為HPS。

表4 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3.2 PCR 鑒定結(jié)果

采用PCR 方法鑒定副豬嗜血桿菌，可以有效區(qū)別臨床癥狀與副豬嗜血桿菌病相似的豬傳染性胸膜肺炎、支原體肺炎、豬鏈球菌病等。并且與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離和生化鑒定等方法相比較，PCR 具有準(zhǔn)確、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)。但有研究發(fā)現(xiàn)，HPS 與巴氏桿菌屬某些細(xì)菌有高度同源性，PCR 方法不排除會出現(xiàn)假陽性。因此，鑒定時還要結(jié)合細(xì)菌分離、生化鑒定等傳統(tǒng)方法，避免假陽性的出現(xiàn)。

3.3 HPS 的生長曲線

本試驗(yàn)采用全自動微生物生長分析系統(tǒng)測定HPS 的生長情況，試驗(yàn)數(shù)據(jù)反映出HPS 連續(xù)培養(yǎng)中，4 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期，14 h 進(jìn)入生長平臺期，此時菌體數(shù)目較大。該試驗(yàn)結(jié)果為滅活疫苗的研制中滅活時間的選取提供了依據(jù)。但不足的是，該試驗(yàn)未能對HPS 在不同時期的活菌數(shù)進(jìn)行測定，希望其他研究人員可以開展此項(xiàng)工作，對HPS 的生長特性深入了解。