付少偉，孫淑敏，謝巖黎

河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室，河南 鄭州 450001

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)是一種主要由鐮刀菌產(chǎn)生的雌激素類毒素，是世界上對糧食污染較廣泛的真菌毒素之一，在谷物及農(nóng)副產(chǎn)品中都可檢測到其存在。該毒素會對生殖系統(tǒng)造成嚴重的損傷并有強烈的致突變、致畸作用，還能引起雌性激素中毒癥及誘發(fā)腫瘤[1]。因此，世界各國對谷物或谷物制品中的玉米赤霉烯酮含量都制定了相應的限量標準。如歐盟規(guī)定精煉玉米油中ZEA不得超過200 μg/kg，我國規(guī)定食用谷物中ZEA不得超過60 μg/kg[2]。目前測定玉米赤霉烯酮的方法主要有儀器分析法(如高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等)及酶聯(lián)免疫法(ELISA)等[3-8]。儀器分析法靈敏度和準確度高，但樣品前處理復雜、成本高、需專業(yè)人員操作；ELISA法操作簡便，靈敏度和特異性較好，是目前用于現(xiàn)場檢測及大樣本量篩查的主要方法，但ELISA的制備需要抗體，玉米赤霉烯酮這類小分子不具有完全抗原，其抗體制備成本高、周期長，易受環(huán)境的干擾，不易保存[9]。

核酸適體作為一種新型分子識別元件，具有可體外合成、易修飾、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，被認為是抗體的良好替代物[10-11]。自玉米赤霉烯酮核酸適體被成功篩選以來，基于核酸適體構建玉米赤霉烯酮生物傳感器(熒光法、比色法、電化學)的報道也日益增多[12-19]。酶聯(lián)適體法與酶聯(lián)免疫法原理類似，是以適體替代抗體作為識別元件，通過直接或間接競爭酶聯(lián)法構建比色傳感器。該方法已用于赭曲霉毒素A(OTA)、腺苷三磷酸(ATP)、卡納霉素等危害因子的檢測，都是以樣品含量與反應顏色成反比關系進行定量[20-24]。作者以玉米赤霉烯酮為檢測對象，基于目標物與ZEA適體鏈的高特異性結合，構建了間接競爭法檢測ZEA的新方法。所設計的反應體系以樣品質(zhì)量濃度與體系顏色成正比關系進行定量，具有顯色結果易判斷、檢測靈敏度高、成本低等特點，為食品中ZEA的檢測提供一種簡便、靈敏、經(jīng)濟的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ZEA核酸適體經(jīng)生物素標記，序列為5′-bio-GAT GGG GAA AGG GTC CCC CTG GGT TGG AGC ATC GGA CA-3′[11]；與ZEA適體部分互補鏈DNA1經(jīng)生物素標記，序列為5′-bio-TGT CCG ATG CTC CAA CC-3′；與DNA1完全互補鏈DNA2經(jīng)生物素標記，序列為5′-bio- GGT TGG AGC ATC GGA CA-3′，以上DNA鏈均由上海生工生物工程有限公司合成并經(jīng)HPLC純化，使用前于-20 ℃冰箱保存，所有溶液(含緩沖液)均用一級超純水配制。

辣根過氧化物酶標記生物素(HRP-Biotin)、鏈霉親和素(SA)、過氧化物酶標記親和素(HRP-SA)、牛血清白蛋白(BSA)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：索萊寶公司；玉米赤霉烯酮標準品(ZEA)、黃曲霉B1標準品(AFB1)、赭曲霉A標準品(OTA)：Sigma公司；玉米赤霉烯酮免疫試劑盒(ELISA試劑盒)：上海快靈生物科技有限公司；玉米油、玉米粒：超市；試驗用水為一級超純水；甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

包被用碳酸鹽緩沖液(CB)：0.05 mol/L，pH 9.6；PBS緩沖液：0.24 g磷酸二氫鉀，1.44 g磷酸氫二鈉，8 g氯化鈉，0.2 g氯化鉀，用濃鹽酸調(diào)至pH 7.4，最后定容到1 L；洗脫液(PBST)：準確稱取0.25 g Tween20，溶解于500 mL PBS緩沖液中。

1.2 主要儀器與設備

RT-6000酶標分析儀：深圳雷杜生命科學股份有限公司；QL-861漩渦振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-3C型酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀(上海)有限公司；XO-1800D超聲波細胞粉碎機：南京先歐生物科技有限公司；YX280A高壓滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗原理

ZEA適體(aptamer)的5′端標記生物素基團(biotin)，通過生物素和鏈霉親和素的結合作用，aptamer被固定到酶標板1上；DNA1為標記有辣根過氧化物酶(HRP)的適體部分互補鏈；DNA2是與DNA1完全互補的單鏈，通過生物素和親和素固定到酶標板2上。當樣品中不含ZEA時，DNA1與aptamer部分互補后固定在酶標板1上，酶標板2中加入TMB后不顯色；當樣品中含有ZEA時，由于靶物與適體特異性結合，使得DNA1解鏈處于游離狀態(tài)。移取含DNA1的溶液至酶標板2中，標記HRP的DNA1通過雙鏈互補配對原則被酶標板2中的DNA2捕獲，催化TMB底物顯藍色，加入H2SO4終止反應后呈黃色，測定波長450 nm處的吸光度。因此，ZEA含量越高，與ZEA適體結合的越多，游離的DNA1越多，即捕獲到酶標板2上的DNA1越多，催化TMB顯色更深，吸光度越大。

1.4 方法

1.4.1 鏈霉親和素包被酶標板的制備

選用碳酸鹽緩沖液分別包被不同質(zhì)量濃度的鏈霉親和素(SA)(0、0.5、1、2、4、8、10、12 μg/mL)。將100 μL SA加入酶標板，37 ℃溫育孵育16 h后，加入100 μL 1.5% BSA封閉1 h。用PBST洗去未固定的SA，得到SA包被的酶標板。在酶標板中加入100 μL HRP-Biotin后37 ℃溫育1 h。PBST洗去未結合至酶標板上的HRP-Biotin，加入100 μL TMB 37 ℃孵育30 min后，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度，優(yōu)化鏈霉親和素質(zhì)量濃度和封閉液。

1.4.2 ZEA適體及互補鏈在酶標板上的包被

在鏈霉親和素包被的酶標板1中加入100 μL 生物素標記的aptamer，在37 ℃孵育30 min，用PBST洗板3次；加入100 μL生物素標記的DNA1，37 ℃孵育30 min，用PBST洗板3次。以相同的方法在酶標板2上包被DNA1的互補鏈DNA2。利用TMB顯色法優(yōu)化適體、DNA1鏈和DNA2鏈的包被濃度。

1.4.3 酶聯(lián)適體競爭法檢測ZEA

將100 μL 不同質(zhì)量濃度的ZEA分別加入到包被ZEA適體和互補鏈的酶標板1中，37 ℃孵育30 min后，將反應液移取到已包被Bio-DNA2的酶標板2中，37 ℃孵育30 min后，用PBST洗板3次；加入100 μL SA-HRP，37 ℃孵育30 min后，用PBST洗板5次；加入100 μL TMB，37 ℃孵育20 min后，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，測定波長450 nm處的吸光度。平行試驗3次。

1.4.4 方法的特異性評價

采用本研究構建的酶聯(lián)適體法同時對50ng/mL的玉米赤霉烯酮(ZEA)、赭曲霉毒素A(OTA)、雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和黃曲霉毒素B1(AFB1)進行測定，通過比較不同反應體系的顏色變化及D(450)評價本試驗方法的特異性。

1.4.5 實際樣品的檢測

分別以建立的酶聯(lián)適體法和市售酶聯(lián)免疫試劑盒對ZEA加標質(zhì)量濃度為50、100 ng/mL的玉米油和玉米樣品進行檢測。玉米樣品依據(jù)GB/T 23504—2009進行預處理后得到濾液為實際樣品液；玉米油樣品的預處理參考孟衛(wèi)芹等[23]的方法。對比兩種方法的樣品回收率和標準偏差，驗證酶聯(lián)適體法對實際樣品檢測的可行性。

2 結果與分析

2.1 包被方法和鏈霉親和素質(zhì)量濃度的優(yōu)化

生物素標記的ZEA適體通過生物素-親和素體系被固定在酶標板上。因此，酶標板上鏈霉親和素的包被量與適體的固定量相關，從而影響酶聯(lián)適體法的檢測靈敏度。主要考察了包被方法和SA質(zhì)量濃度對顯色體系的影響。干法包被和濕法包被的選擇通常與酶標板有關，本試驗選用JET BIOFIL板。干法于37 ℃溫育16 h至包被液完全烘干,濕法于4 ℃包被過夜(16 h)。結果如圖1所示，干法包被的效果整體優(yōu)于濕法包被；在0～4 μg/mL的范圍內(nèi)，隨著SA質(zhì)量濃度的增大，顯色體系的吸光度不斷增加，顏色逐漸加深。當SA溶液的質(zhì)量濃度達到4 μg/mL時，干法包被和濕法包被在450 nm處的吸光度均基本達到穩(wěn)定，表明SA在酶標板孔中的包被已達到飽和。因此，選擇干法包被作為本試驗的包被方法，4 μg/mL為SA的最佳包被質(zhì)量濃度。

圖1 不同包被方法及SA包被質(zhì)量濃度的優(yōu)化

2.2 封閉液的優(yōu)化

為了避免試驗過程中發(fā)生非特異性吸附，提高檢測的準確性，需要在酶標板包被SA后加入封閉液封閉多余位點。考察了酪蛋白、BSA和明膠溶液3種常用封閉液的封閉效果。由圖2可知，在最優(yōu)的包被條件下，以2.00%BSA為封閉液處理1 h所得的空白檢測值最低，因此，選擇質(zhì)量分數(shù)2.00%的BSA作為封閉液。

圖2 封閉液的優(yōu)化

2.3 適體及互補鏈濃度的優(yōu)化

在已包被好SA的酶標板孔加入Bio-Aptamers，Bio-Aptamers與SA結合，再加入Bio-HRP和剩余的位點結合，因此450 nm處的吸光度隨著Bio-Aptamers濃度的增加而降低，當吸光度趨于平衡時，即Bio-Aptamers結合量已達到飽和，此時的濃度為試驗的最優(yōu)適體濃度。如圖3a所示，當適體濃度為270 nmol/L時，吸光度已趨于穩(wěn)定，溶液顏色也無明顯差異，因此,適體的最佳濃度為270 nmol/L。

圖3 適體及互補鏈濃度優(yōu)化

在適體優(yōu)化的基礎上，對Bio-DNA1的濃度進行優(yōu)化。加入Bio-DNA1與已固定在酶標板上的適體互補結合，加入SA-HRP顯色。Bio-DNA1結合的越多，吸光度越大，顏色也就越明顯。當Bio-DNA1的添加量達到10 nmol/L時，樣品的吸光度達到最大并保持穩(wěn)定(圖3b)，表明與適體結合的Bio-DNA1量已達到飽和，因此Bio-DNA1的最佳濃度為10 nmol/L。同時對酶標板2上包被的Bio-DNA2濃度進行優(yōu)化(圖3c)。優(yōu)化原理與Bio-Aptamers的選擇優(yōu)化一樣，當吸光度隨著濃度的增大而保持穩(wěn)定時，表明Bio-DNA2與SA的結合位點達到飽和。因此，選擇Bio-DNA2的最優(yōu)濃度為90 nmol/L。

2.4 標準曲線的建立及特異性研究

在最優(yōu)試驗條件下，考察酶聯(lián)適體競爭法對不同質(zhì)量濃度ZEA的響應情況。ZEA和適體發(fā)生特異性結合，導致酶標板1中的DNA1鏈從適體鏈上解離，與酶標板2中包被的DNA2鏈互補結合，并通過生物素-親和素作用被HRP標記。隨著ZEA適體質(zhì)量濃度的增大，解離的DNA1鏈越多，被DNA2鏈捕獲的HRP標記DNA1鏈也越多，導致反應體系的D(450)逐漸增大，溶液顏色逐漸加深。由圖4可知，在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)，ZEA的質(zhì)量濃度與反應體系的吸光度呈良好的線性關系，回歸方程為y=0.004 3x+2.497 6(R2=0.995 9)，由LOD=3SD/S(LOD為檢出限，SD為空白樣品均值標準偏差，S為線性回歸方程斜率)計算可得，該方法的檢出限為0.44 ng/mL，可滿足ZEA的檢測需求。

圖4 ZEA質(zhì)量濃度與反應體系D(450)的關系

為考察該方法的特異性，分別以常與ZEA共存的AFB1、OTA和DON等幾種真菌毒素為目標物進行檢測。在最優(yōu)試驗條件下，采用酶聯(lián)適體法對50 ng/mL ZEA、OTA、AFB1和DON的檢測結果如圖5所示，加入OTA、AFB1和DON后樣品的D(450)與空白值基本一致，兩者之間的差值接近于0；而加入ZEA后反應體系的D(450)明顯增大。該結果充分表明酶聯(lián)適體法檢測ZEA具有良好的特異性。

圖5 特異性分析

2.5 實際樣品檢測

分別采用本研究中建立的酶聯(lián)適體法和市售ELISA試劑盒對加標量為50、100 ng/mL的玉米和玉米油樣品進行檢測，計算樣品的加標回收率和相對標準偏差(RSD)。由表1可知，本研究建立的方法測定實際樣品的加標回收率和標準偏差與ELISA法測定的結果基本相同，表明該方法具有和ELISA法相同的檢測靈敏度和重復性，可用于食品中ZEA的檢測。

表1 谷物制品中ZEA的檢測回收率(n=6)

3 結論

以核酸適體為識別元件，構建了基于酶聯(lián)適體競爭法檢測ZEA的快速檢測新方法。在最優(yōu)試驗條件下，反應體系中ZEA質(zhì)量濃度與吸光度在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系，方法的檢出限為0.44 ng/mL。該方法具有靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、結果可視化、樣品處理簡便等特點，可用于食品中ZEA的快速篩查和現(xiàn)場檢測。此外，該方法具有通用性，可進一步拓展至食品中其他真菌毒素的檢測應用中。