蔡 拓 張 慈 易吉平 余曉巍?

(1.湖南省職業(yè)病防治院,長(zhǎng)沙 410007;2.中南大學(xué)湘雅護(hù)理學(xué)院,長(zhǎng)沙 410013)

高脂血癥又稱(chēng)為血脂異常或脂代謝紊亂,是引起心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一。其中以低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)增高、血清總膽固醇(total cholesterol,TC)增高、甘油三酯(triglyceride,TG)增高或高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)降低為特點(diǎn)的血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)重要的危險(xiǎn)因素[1-3]。

高脂血癥預(yù)防及治療藥物研究有希望減輕ASCVD 給人類(lèi)帶來(lái)的痛苦,降低疾病負(fù)擔(dān)。建立理想的降血脂評(píng)價(jià)體系是研究降血脂藥物首要且重要的一環(huán)。常用的降血脂效果評(píng)價(jià)體系包括建立降血脂動(dòng)物模型和降血脂體外評(píng)價(jià)體系[4]。高脂飼料喂養(yǎng)建立的高血脂動(dòng)物模型符合人類(lèi)高血脂癥形成特點(diǎn)[5],同時(shí)選取SD 大鼠作為模型動(dòng)物具有成本低、易于操作、穩(wěn)定性好、取血量大等優(yōu)點(diǎn)[6],故用高脂飼料喂養(yǎng)SD 大鼠常用于高血脂動(dòng)物模型的建立。

王燕萍等[7]研究探討了通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠4～8 周成功構(gòu)建高血脂模型,發(fā)現(xiàn)造模過(guò)程中大鼠血脂水平出現(xiàn)“升高-適應(yīng)-升高”的內(nèi)調(diào)節(jié)過(guò)程,4～8 周的高脂飲食不會(huì)引起主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)改變但可以誘發(fā)大鼠出現(xiàn)中度至重度脂肪肝,但該方法造模時(shí)間較長(zhǎng),不適宜大規(guī)模推廣。2012年,國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的“輔助降血脂評(píng)價(jià)方法”[8]中提出:建議使用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠1～2 周建立高血脂模型,鄭立新等[9]報(bào)道使用該方法推薦的飼料喂養(yǎng)大鼠7 d 后可成功建立混合型高脂模型,由于不同實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)環(huán)境差別較大、在該方法推薦的時(shí)間范圍構(gòu)建的動(dòng)物模型血液指標(biāo)可能存在波動(dòng)、且存在用該方法構(gòu)建的高脂模型是否會(huì)引起動(dòng)物組織器官出現(xiàn)病理性改變等問(wèn)題,本研究旨在通過(guò)使用高脂飼料喂養(yǎng)SD 大鼠兩次建立高脂血癥模型,比較不同造模時(shí)間動(dòng)物血液檢測(cè)指標(biāo)及肝形態(tài)的變化規(guī)律,初步探討模型的建立原理,為現(xiàn)行“輔助降血脂評(píng)價(jià)方法”推廣及應(yīng)用提供證據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠,8 周齡共144 只,體重(200±20)g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在湖南省職業(yè)病防治院的屏障環(huán)境中完成[SYXK(湘)2017-0001]。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境:溫度22℃～26℃,相對(duì)濕度56%～70%,12 h 明暗交替。研究方案經(jīng)湖南省職業(yè)病防治院GLP 毒理實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審核通過(guò)(JZ03020180008),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

血清總膽固醇檢測(cè)試劑盒(批號(hào)0119011)、甘油三酯檢測(cè)試劑盒(批號(hào)1218071)、高密度脂蛋白-膽固醇檢測(cè)試劑盒(批號(hào)1018072)購(gòu)自四川新健康成生物股份有限公司;低密度脂蛋白-膽固醇檢測(cè)試劑盒(批號(hào)1806071119),購(gòu)自美康生物試劑。日立-7600 全自動(dòng)生化分析儀;湘鷹TD6-WS 離心機(jī);德國(guó)蔡司Axio Lab.A1 系統(tǒng)顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 飼料

維持飼料、模型飼料均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。模型飼料配方[10]:49.3%維持飼料、20.0%蔗糖、15%豬油、12.5%酪蛋白、1.2%膽固醇、1.3%磷酸氫鈣、0.5%石粉、0.2%膽酸鈉。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

大鼠于屏障系統(tǒng)下喂飼維持飼料觀察5 d。造模兩次,每次造模選用72 只動(dòng)物,使用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分成模型組和對(duì)照組,模型組60 只動(dòng)物,對(duì)照組12 只。動(dòng)物按組別群養(yǎng),4 只/盒,自由進(jìn)食及飲水。本文將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組當(dāng)天定義為第0 天。

1.3.3 飼料給予

模型組大鼠給予模型飼料,對(duì)照組大鼠給予維持飼料,飼料不限量。

1.3.4 動(dòng)物體重測(cè)量

第一次造模于第0 天,第7 天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行稱(chēng)重;第二次造模于第0 天、第7 天、第13 天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行稱(chēng)重。計(jì)算動(dòng)物體重增長(zhǎng)率(體重增重/實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重×100%)。

1.3.5 血液生化指標(biāo)測(cè)定

兩次造模分別于給予模型飼料后第8 天及第14 天進(jìn)行不禁食采血。采血前使用大鼠固定板對(duì)動(dòng)物進(jìn)行固定,使用一次性注射器(2.5 mL)經(jīng)頸靜脈竇采血。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)。

1.3.6 組織病理學(xué)檢查

股動(dòng)脈放血處死動(dòng)物,取肝用福爾馬林溶液固定,用刀片切取3～5 mm 邊緣齊整的組織經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、組織切片、常規(guī)脫蠟、HE 染色、脫水及封片后,在光學(xué)顯微鏡下觀察、攝像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS(V20.0)對(duì)各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制Q-Q圖、計(jì)算偏度值、峰度值和標(biāo)準(zhǔn)誤,判斷其是否服從正態(tài)分布。計(jì)算Pearson 相關(guān)系數(shù)r并進(jìn)行分級(jí)。當(dāng)r的絕對(duì)值大于等于0.7 時(shí),兩變量為高度相關(guān);當(dāng)r的絕對(duì)值大于等于0.4,小于0.7 時(shí),兩變量為中度相關(guān);當(dāng)r的絕對(duì)值小于0.4 時(shí),為低度相關(guān)[11]。計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 正態(tài)性分析

通過(guò)繪制Q-Q 圖以及綜合各組數(shù)據(jù)分布的偏度值、峰度值和標(biāo)準(zhǔn)誤對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行正態(tài)性分析,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前后體重、體重增長(zhǎng)率及血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(TC、TG、LDL-C、HDL-C)均服從正態(tài)分布。

2.2 體重及血液生化指標(biāo)的測(cè)定

記錄第一次造模第0 天和第7 天以及第二次造模第0 天、第7 天和第13 天動(dòng)物體重,計(jì)算造模結(jié)束時(shí)動(dòng)物體重增長(zhǎng)率,檢測(cè)造模結(jié)束后大鼠血脂水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果詳見(jiàn)表1、表2。

表1 第一次造模(8 d)動(dòng)物體重及血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of body weight and blood biochemical indexes in the first modeling (8 days)

表2 第二次造模(14 d)動(dòng)物體重及血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of body weight and blood biochemical indexes in the second modeling (14 days)

2.3 單次造模模型組與對(duì)照組數(shù)據(jù)比較

第一次造模,模型組與對(duì)照組動(dòng)物第0 天體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模第7 d,模型組動(dòng)物體重低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);模型組TC、TG、LDL-C 值均高于對(duì)照組,模型組HDL-C 值低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

第二次造模,模型組與對(duì)照組動(dòng)物體重不同時(shí)間點(diǎn)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組TC、TG、LDL-C 值均高于對(duì)照組,模型組HDL-C 值低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 兩次造模模型間數(shù)據(jù)比較

兩次造模對(duì)照組之間TC、TG、LDL-C、HDL-C 值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩次造模模型組之間TC、LDL-C 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);造模14 d 模型組TG 均值為造模8 d 模型組均值的137.8%,造模14 d 模型組HDL-C 均值為造模8 d模型組均值的81.5%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5 各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析

結(jié)果顯示:兩次造模對(duì)照組動(dòng)物TC/LDL-C、TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C 均呈正相關(guān)(P<0.01);模型組動(dòng)物TC/TG、TC/LDL-C、TG/LDL-C、TG/體重增長(zhǎng)率均呈正相關(guān)(P<0.05 或P<0.01),TG/HDL-C 均呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。其余檢測(cè)指標(biāo)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。相關(guān)程度詳見(jiàn)表3、表4。

2.6 肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果

正常對(duì)照組可見(jiàn)肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝竇清晰可見(jiàn),肝索排列整齊,肝細(xì)胞核位于細(xì)胞中央,細(xì)胞質(zhì)豐富。

給予模型飼料8 d 后,肝出現(xiàn)彌漫性水樣改變,肝竇受壓,肝索尚正常,肝細(xì)胞胞漿腫大疏松化。

給予模型飼料14 d 后,肝出現(xiàn)彌漫性水樣改變伴輕度脂肪變性(脂變程度小于1/3),肝竇變窄,肝索排列紊亂,肝細(xì)胞胞漿腫大疏松化、出現(xiàn)小脂滴。詳見(jiàn)圖1。

3 討論

近年來(lái),我國(guó)對(duì)于化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)形成高血脂動(dòng)物模型的研究有諸多報(bào)道,研究發(fā)現(xiàn)不同的動(dòng)物品系、年齡、體重、飼養(yǎng)環(huán)境,不同高脂飼料配方以及采用不同檢測(cè)方法等影響因素對(duì)建模成功時(shí)間以及檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果有較大影響[12-15]。因此,對(duì)于保健品和藥物研發(fā)者而言,針對(duì)各種研究及實(shí)踐的需要篩選出合適的高血脂動(dòng)物模型,并依此在國(guó)內(nèi)制定完善的標(biāo)準(zhǔn)非常必要且迫切。對(duì)于第三方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室而言,掌握模型的特點(diǎn)和變化規(guī)律,及時(shí)建立規(guī)范化的歷史背景值參考體系,對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得出正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)論有重要意義。

表3 兩次造模對(duì)照組動(dòng)物體重增長(zhǎng)率及血液生化指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of body weight growth rate and blood biochemical indexes in two control groups

表4 兩次造模模型組動(dòng)物體重增長(zhǎng)率及血液生化指標(biāo)相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of body weight growth rate and blood biochemical indexes in two modeling groups

圖1 大鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果Note.A,Control group.B,Control group.C,Modeling for 8 days.D,Modeling for 8 days.E,Modeling for 14 days .F,Modeling for 14 days.Figure 1 Histopathological examination of rat liver

本研究比較了短期內(nèi)依照相同標(biāo)準(zhǔn)在相同環(huán)境條件下進(jìn)行的兩次造模,除動(dòng)物批次及造模時(shí)間不一致,其余研究因素均相同。研究的主要目的在于檢驗(yàn)在1～2 周時(shí)間內(nèi),本實(shí)驗(yàn)室是否可以依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)建立穩(wěn)定可靠的降血脂大鼠模型,為建立實(shí)驗(yàn)室歷史背景值提供參考。

據(jù)報(bào)道,當(dāng)TG>4.52 mmol/L 時(shí),Friedewald 公式計(jì)算法、改良Friedewald 公式計(jì)算法及新公式計(jì)算法均不能準(zhǔn)確估算LDL-C 值[16]。本研究中,兩次造模模型組TG>4.52 mmol/L 的動(dòng)物數(shù)量分別占總數(shù)的31%和47%,故高血脂模型LDL-C 值一律采用直接測(cè)定法獲得。

兩次造模模型組動(dòng)物血清TC、TG、LDL-C 值均高于對(duì)照組,模型組HDL-C 值均低于對(duì)照組;造模時(shí)間延長(zhǎng),TG 水平增高,HDL-C 水平降低。以上結(jié)果表明兩次造模SD 大鼠高脂血癥模型均建立成功,且均為混合型高脂血癥模型[7]。

本研究中模型組與對(duì)照組動(dòng)物TC 及LDL-C 結(jié)果基本平行,且兩個(gè)指標(biāo)在模型組和對(duì)照組中均體現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性。攝入高脂飼料后,模型組動(dòng)物TG 與TC、LDL-C、HDL-C、體重增長(zhǎng)率出現(xiàn)不同程度相關(guān),可能因?yàn)門(mén)G 值較其它指標(biāo)更易受飲食或時(shí)間等因素影響;而模型組HDL-C 與TC、LDL-C 相關(guān)性消失,或可部分歸因于高TG 血癥與HDL-C 降低的相關(guān)性,有待進(jìn)一步研究;經(jīng)比較,兩次造模各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性趨勢(shì)高度一致。以上結(jié)果與諸駿仁等[2]的報(bào)道基本相符。結(jié)果顯示,模型組動(dòng)物體重增長(zhǎng)率僅與TG 值存在相關(guān)性且呈弱相關(guān),說(shuō)明該方法所用飼料可明顯改變動(dòng)物血脂水平,但對(duì)動(dòng)物體重影響較小。

當(dāng)造模時(shí)間為8 d 時(shí),模型組動(dòng)物第7 天體重低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);當(dāng)造模時(shí)間為14 d 時(shí),模型組與對(duì)照組動(dòng)物體重不同時(shí)間點(diǎn)比較差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但第7 天體重絕對(duì)值低于對(duì)照組(P=0.088)。基于此現(xiàn)象,如果研究中動(dòng)物體重為模型應(yīng)用階段重要分析指標(biāo),研究者可通過(guò)在造模階段增加動(dòng)物數(shù)、造模結(jié)束后將體重納入篩選指標(biāo)等手段,盡可能消除因造模產(chǎn)生的動(dòng)物體重差異。鄭立新等[9]認(rèn)為動(dòng)物體重波動(dòng)可能因?yàn)閯?dòng)物脂代謝紊亂、形成脂肪肝從而影響動(dòng)物攝食所致;而胡慧明等[17]提出因飼料具有高糖、高脂的特點(diǎn),從而導(dǎo)致短期內(nèi)部分動(dòng)物不適應(yīng)產(chǎn)生厭食。如果模型組動(dòng)物的飲水量、攝食量低于對(duì)照組,說(shuō)明短時(shí)間內(nèi)可能因?yàn)轱暳峡诟械仍驅(qū)е聞?dòng)物的攝食量降低從而影響動(dòng)物生長(zhǎng);如果模型組動(dòng)物的飲水、攝食情況與對(duì)照組比較無(wú)差異,說(shuō)明該飼料并不會(huì)引起動(dòng)物厭食,動(dòng)物體重波動(dòng)可能來(lái)自代謝紊亂。因本研究未對(duì)動(dòng)物飲水及進(jìn)食情況進(jìn)行監(jiān)測(cè),故無(wú)法準(zhǔn)確判斷動(dòng)物體重波動(dòng)原因。

病理組織學(xué)結(jié)果表明,使用高脂飼料喂養(yǎng)動(dòng)物8 d 和14 d 均可誘發(fā)肝病理性改變,且病變程度與造模時(shí)間呈正相關(guān)。證明短時(shí)間內(nèi)大量使用含有膽固醇、蔗糖、豬油、膽酸鈉的飼料喂養(yǎng)動(dòng)物可誘發(fā)急性肝損傷從而形成脂代謝紊亂。

綜上所述,本研究所用的造模方法在8～14 d內(nèi)均可建立SD 大鼠混合型高脂血癥模型,該方法建立的模型具有造模時(shí)間短、關(guān)鍵指標(biāo)穩(wěn)定以及重現(xiàn)性好的特點(diǎn)?？蓮V泛應(yīng)用于飲食因素對(duì)血脂影響的研究、輔助降血脂功能保健食品以及調(diào)血脂藥物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。本研究結(jié)果既可為本實(shí)驗(yàn)室相似研究提供依據(jù),又可為將來(lái)制定參考值范圍以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。