張燕華鄭智勇李海濤陳 凱

(山東省藥學科學院,山東省化學藥物重點實驗室,濟南 250101)

安全藥理學(safety pharmacology)主要是研究藥物在治療范圍內(nèi)或以上的劑量時,潛在的不期望出現(xiàn)的對生理功能的不良影響,即觀察藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的影響[1]。呼吸系統(tǒng)實驗作為安全藥理學核心組合實驗的一部分,經(jīng)歷了從麻醉動物到清醒動物,從模擬化信號到數(shù)字化信號的轉(zhuǎn)變[2-4]。根據(jù)《藥物安全藥理學評價研究技術(shù)指導原則》和ICH S7A 的要求,目前國內(nèi)公認的試驗方法為采用全身體積描記法監(jiān)測大鼠呼吸系統(tǒng)指標。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認證管理中心頒布的藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范認證標準檢查要點中的要求,大鼠全身體積描記系統(tǒng)作為計算機化系統(tǒng),使用前需進行操作和性能確認,安裝確認(installation qualification,IQ)、操作確認(operational qualification,OQ)、性能確認(performance qualification,PQ)[5-6]。本研究通過給予SD 大鼠巴氯芬和氨茶堿對全身體積描記檢測系統(tǒng)進行性能確認。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD 大鼠,SPF 級,90 只,雌雄各半,6～8 周齡,雌性體重202～228 g,雄性體重238～262 g,均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011]。飼養(yǎng)于山東省藥學科學院新藥評價中心[SYXK(魯)2018-0031],飼養(yǎng)間溫度控制在20℃～26℃,濕度40%～70%,每小時換氣次數(shù):≥15次,100%全新風,光照為12 h 明暗交替。動物試驗中涉及的動物所有操作程序符合3R 原則,已經(jīng)得到山東省藥學科學院新藥評價中心實驗動物管理和使用委員會的批準(IACUC-2019-104、IACUC-2020-R033)。

1.2 主要試劑與儀器

巴氯芬片,批號為TT599,每片含量為10 mg,生產(chǎn)單位為諾華制藥;氨茶堿片,批號為1901196,規(guī)格為0.1 g:100 片,生產(chǎn)單位為山東新華制藥股份有限公司。UW2200H 電子天平,日本島津;全身體積描記檢測系統(tǒng),美國DSI 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

采用SPSS 軟件的隨機區(qū)組設計分組方法,根據(jù)性別和體重,隨機選擇30 只動物(雌雄各半)分配到3 組,分別為空白對照組、巴氯芬組、氨茶堿組。每組10 只動物,雌雄各半。

1.3.2 給藥

巴氯芬組給藥劑量為30 mg/kg,氨茶堿組給藥劑量為30 mg/kg。各組給藥途徑均為經(jīng)口灌胃,給藥體積均為10 mL/kg。

1.3.3 檢測方法

給藥開始前,在FinePointe 采集軟件中對系統(tǒng)進行一鍵校準,并創(chuàng)建新的study,根據(jù)采集時長和間隔建立采集模板。將動物在給藥前約60 min 放入全身體積描記箱中進行適應,并采集5 min 穩(wěn)定的數(shù)據(jù)作為藥前基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。給藥時將動物暫時取出,給藥后將動物立即放回全身體積描計箱,并采集給藥后1 h、2 h、4 h 的數(shù)據(jù),將藥后各時間段前后各2 min 數(shù)據(jù)的平均值作為相應時間點的呼吸功能檢測結(jié)果。

1.3.4 檢測指標

呼吸頻率(f),單位:bpm(次/分);潮氣量(TVb),單位:mL;每分通氣量(MVb),單位mL/min。

1.3.5 系統(tǒng)穩(wěn)定性實驗

在不同的時間選用不同的動物,給藥劑量和檢測方法不變,將以上實驗步驟(1.3.1～1.3.3)重復2 次,將后兩次的結(jié)果與第一次結(jié)果進行比較,以檢驗系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 巴氯芬對SD 大鼠f、TVb、MVb 的影響

如圖1 所示,給予30 mg/kg 的巴氯芬后,與空白對照組比較:給藥后1 h、2 h 和4 h,大鼠的f 顯著降低,變化率分別為33.9%、55.6%和21.7%,TVb顯著升高,變化率分別為75%、136.4%和73.9%,其差異均具有時間相關(guān)性和統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與空白對照組比較,MVb 變化不明顯且無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.2 氨茶堿對SD 大鼠f、TVb、MVb 的影響

如圖1 所示,給予30 mg/kg 的氨茶堿后,與空白對照組比較:給藥后1 h、2 h 和4 h,大鼠的f 顯著升高,變化率分別為216.5%、131.3%和22.6%,MVb 顯著升高,變化率分別為186.7%、105.4%和49.9%,其差異均具有時間相關(guān)性和統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與空白對照組比較,TVb 變化不明顯且無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.3 系統(tǒng)穩(wěn)定性實驗結(jié)果

如圖2 和圖3 所示,兩次重復實驗結(jié)果均顯示:與同期空白對照組比較,巴氯芬組給藥后1 h、2 h和4 h,大鼠的f 顯著降低,Tvb 顯著升高,Mvb 變化不明顯,氨茶堿組給藥后1 h、2 h 和4 h,大鼠的f、Mvb 顯著升高,Tvb 變化不明顯,后兩次結(jié)果的f、Tvb、Mvb 的變化趨勢與第一次結(jié)果一致。

3 討論

巴氯芬是γ-氨基丁酸的衍生物,臨床作為解痙藥主要用于肌肉痙攣狀態(tài)的治療,其主要作用機制可能為干擾興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放,抑制脊髓突觸間的傳導,對運動神經(jīng)元產(chǎn)生抑制作用,產(chǎn)生緩解肌肉痙攣的療效[7]。氨茶堿片是茶堿與乙二胺復鹽,茶堿是藥理作用的主要成分,具有松弛呼吸道平滑肌、增強膈肌收縮力的作用,有益于改善呼吸功能[8]。本研究通過全身體積描記法明確觀察到SD大鼠給予巴氯芬后會導致呼吸頻率減慢,給予氨茶堿后會導致呼吸頻率加快,表明全身體積描記檢測系統(tǒng)可以準確的檢測到動物呼吸頻率和潮氣量的變化。這一結(jié)果與相關(guān)文獻報道基本一致[5]。

采用相同的藥物在不同的時間給予不同的動物,對以上試驗進行了兩次重復實驗,結(jié)果f、Tvb、Mvb 的變化趨勢與第一次結(jié)果一致,表明在不同的時間通過全身體積描記檢測系統(tǒng)得出的數(shù)據(jù)具有較強的穩(wěn)定性。進一步表明此系統(tǒng)更適用于包含多次實驗的研究中。

全身體積描記檢測系統(tǒng)為將動物放入全身體積描記箱內(nèi),使動物處于清醒、無束縛狀態(tài)下,通過檢測動物呼吸時引起的腔體內(nèi)氣壓的改變測量其肺功能參數(shù)[9-10]。相對于用麻醉動物進行試驗,這種無束縛的方式可排除動物因麻醉時間、麻醉深度、創(chuàng)傷應激等因素的干擾,同時增加受試物的檢測靈敏度,使結(jié)果更客觀、準確,更接近臨床[11];全身體積描記法可長時間連續(xù)監(jiān)測,所得數(shù)據(jù)更接近真實值,更能反映動物在正常自然的狀態(tài)下的生理狀況[12]。相比對于大動物遙測法用模擬信號測定呼吸系統(tǒng)指標,這種方式可排除動物因呼吸帶位置的滑動或動物體位的改變造成的干擾,測得的大鼠呼吸指標更準確、更全面且數(shù)據(jù)更穩(wěn)定,除了常規(guī)的呼吸頻率和潮氣量外還可以測定氣道阻力等,且大鼠成本低廉,抓取操作容易方便[13]。

圖1 巴氯芬、氨茶堿對大鼠f、TVb、MVb 的影響(第1 次結(jié)果)Note.Compared with the control group,?P<0.05.Figure 1 Influence of baclofen and aminophylline on respiratory rate,tidal volume box and minute ventilation box of rats(The first data)

圖2 巴氯芬、氨茶堿對大鼠f、TVb、MVb 的影響(第2 次結(jié)果)Note.Compared with the control group,?P<0.05.Figure 2 Influence of baclofen and aminophylline on respiratory rate,tidal volume box and minute ventilation box of rats(The second data)

圖3 巴氯芬、氨茶堿對大鼠f、TVb、MVb 的影響(第3 次結(jié)果)(,n=10)Note.Compared with the control group,?P<0.05.Figure 3 Influence of baclofen and aminophylline on respiratory rate,tidal volume box and minute ventilation box of rats(The third data)

本研究表明,SD 大鼠給予巴氯芬和氨茶堿后,通過全身體積描記法可以有效的監(jiān)測到大鼠呼吸功能指標的變化。此方法簡便快捷、靈敏度高,數(shù)據(jù)穩(wěn)定,可及時有效的監(jiān)測SD 大鼠給予受試物后引起的呼吸功能指標的變化,本系統(tǒng)可以應用到非臨床安全藥理試驗研究中。