史方海陳忠仁

(海口市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,?？?570208)

肺纖維化是肺慢性炎癥的主要危害,例如慢性阻塞性肺疾病或哮喘,氣道慢性炎癥促使局部大量的促纖維化生長(zhǎng)因子分泌[1],成纖維細(xì)胞增生并向肌原成纖維細(xì)胞分化,重塑氣道,誘發(fā)肺臟間質(zhì)纖維化,最終導(dǎo)致患者肺功能的損害,可見(jiàn)阻止成纖維細(xì)胞增生以及氣道重建是干預(yù)肺慢性炎癥肺功能危害的關(guān)鍵[2]。羅格列酮(rosiglitazone,RGZ)是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)激動(dòng)劑,臨床使用中發(fā)現(xiàn)RGZ 還具有具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的功效[3],有研究顯示RGZ 可以抑制肺部炎癥,發(fā)揮肺損傷保護(hù)作用[4-5]。p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein ki-nase,p38MAPK)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在成纖維細(xì)胞的增殖分化中也發(fā)揮著重要作用[6]。本研究觀察了RGZ 對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖的影響,并探討p38MAPK 通路在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人胚肺成纖維細(xì)胞株(human embryonic lung fibroblast,HELF)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑與儀器

RGZ 購(gòu)自太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠;青霉素、鏈霉素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、碘化丙啶(PI)購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物技術(shù)材料研究所;胰蛋白酶、高糖DMEM 干粉培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司;蛋白裂解液、Bradford 蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)公司;I 型膠原蛋白(Col I)、III 型膠原蛋白(Col III)、P-p38MAPK、p38MAPK 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司;MK3 多功能酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo Fisher 公司產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman Coulter 公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

HELF 細(xì)胞于37℃、5% CO2環(huán)境下,培養(yǎng)于10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中,細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)胰酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)分為:對(duì)照組、TGF-β1 組、低劑量RGZ(2 mmol/L,LD-RGZ)組和高劑量RGZ(4 mmol/L,HD-RGZ)組[5]。對(duì)照組正常培養(yǎng),TGF-β1 組培養(yǎng)液中加入TGF-β1 至終濃度為10 μmol/L,LDRGZ 和HD-RGZ 組培養(yǎng)液中加入10 μmol/L TGFβ1 后,再分別加入2 mmol/L 或4 mmol/L RGZ。

1.3.2 CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)

對(duì)照組、TGF-β1 組、LD-RGZ 組和HD-RGZ 組細(xì)胞,4000 個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板,每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h、24 h、72 h 后,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)每孔加入10 μL CCK-8 液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處吸光度值即OD450值。

1.3.3 細(xì)胞周期檢測(cè)

對(duì)照組、TGF-β1 組、LD-RGZ 組和HD-RGZ 組細(xì)胞,1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔板,每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,24 h 后胰酶消化收集細(xì)胞,迅速注入4℃70%冷乙醇中固定24 h,1000 r/min 離心5 min,PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞3 次,加入10 μmol/L PI 置冰上待測(cè),流式細(xì)胞儀完成檢測(cè),儀器自帶Cell Quest 軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.3.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

對(duì)照組、TGF-β1 組、LD-RGZ 組和HD-RGZ 組細(xì)胞,1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔板,每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,24 h 后胰酶消化收集細(xì)胞,1000 r/min 離心5 min,PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞3 次,每個(gè)樣品加入100 μL 蛋白裂解液,使用Bradford 蛋白定量試劑盒定量后,每個(gè)樣品取10 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳,轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF 膜,5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h 后,加入一抗,4℃孵育過(guò)夜,換二抗孵育2 h,壓片,顯影,定影,用Image-J 軟件對(duì)照內(nèi)參GAPDH蛋白,計(jì)算目的蛋白Col I、Col III、P-p38MAPK 和p38MAPK 的相對(duì)灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析,多組均數(shù)間比較使用方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RGZ 對(duì)HELF 細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組、TGF-β1 組、LD-RGZ 組和HD-RGZ組細(xì)胞在24 h、48 h 和72 h 時(shí)OD450值存在顯著差異(P<0.05)。其中,24 h、48 h 和72 h 時(shí)HDRGZ 組OD450值顯著低于LD-RGZ 組(P<0.05),LD-RGZ 組又顯著低于TGF-β1 組(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 RGZ 對(duì)HELF 細(xì)胞周期的影響

對(duì)照組、TGF-β1 組、LD-RGZ 組和HD-RGZ 組G1 期細(xì)胞分別占細(xì)胞周期的(91.23±6.32)%、(70.35± 4.14)%、(76.12 ± 4.38)% 和(82.35 ±5.16)%,各組間存在顯著差異(P<0.05)。其中,HD-RGZ 組G1 期細(xì)胞比例顯著高于LD-RGZ 組(P<0.05),LD-RGZ 組又顯著高于TGF-β1 組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 RGZ 對(duì)HELF 細(xì)胞Col I 和Col III 蛋白的影響

從表2 和圖3 可見(jiàn),對(duì)照組、TGF-β1 組、LDRGZ 組和HD-RGZ 組細(xì)胞Col I 和Col III 蛋白表達(dá)存在顯著差異(P<0.01)。其中HD-RGZ 組Col I 和Col III 蛋白顯著低于LD-RGZ 組(P<0.01),LDRGZ 組又顯著低于TGF-β1 組(P<0.01)。

2.4 RGZ 對(duì)HELF 細(xì)胞p38MAPK 通路的影響

從表2 和圖3 可見(jiàn),對(duì)照組、TGF-β1 組、LDRGZ 組和HD-RGZ 組細(xì)胞p38MAPK 蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05),而P-p38MAPK 蛋白表達(dá)存在顯著性差異(P<0.01)。其中HD-RGZ 組Pp38MAPK 蛋白顯著低于LD-RGZ 組(P<0.01),LDRGZ 組又顯著低于TGF-β1 組(P<0.01)。

3 討論

氣道的慢性炎癥導(dǎo)致間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖,產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì),重建氣道是肺纖維的病理生理基礎(chǔ)[7]。PPARγ 激動(dòng)劑羅格列酮抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、分泌致炎因子,拮抗氣道炎癥已被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮可以通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮素、一氧化氮等一些生物活性物質(zhì)抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖[10]。TGF-β1 是刺激成纖維細(xì)胞增殖的常用細(xì)胞因子,并且研究已證實(shí)了TGF-β1 的致纖維化功能[11],本研究顯示HD-RGZ 組細(xì)胞增殖的OD450值顯著低于LD-RGZ 組(P<0.05),LD-RGZ 組又顯著低于TGF-β1 組,說(shuō)明了RGZ 可以抑制TGFβ1 誘導(dǎo)的HELF 細(xì)胞增殖,而且隨著RGZ 劑量的增加抑制活性也升高。細(xì)胞周期分析顯示RGZ 主要將HELF 細(xì)胞阻滯于G0/G1 期,減少進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞比例,上述結(jié)果說(shuō)明了RGZ 可以計(jì)量依賴(lài)性的抑制TGF-β1 刺激的肺成纖維細(xì)胞增殖。

表1 四組細(xì)胞OD450值的比較(n=6)Table 1 Comparison of OD450values of four groups

圖1 細(xì)胞增殖的CCK-8 分析Figure 1 CCK-8 analysis of cell proliferation

圖2 四組細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀檢測(cè)Figure 2 Flow cytometry detection of cell cycle in four groups

表2 四組細(xì)胞Col I、Col III、P-p38MAPK 和p38MAPK 蛋白的相對(duì)灰度值比較(n=6)Table 2 Comparison of relative gray values of Col I,col III,P-P38MAPK and p38MAPK proteins in four groups

圖3 蛋白表達(dá)的Western blot 檢測(cè)Figure 3 Western blot analysis of protein expression

p38MAPK 是機(jī)體內(nèi)一條重要的細(xì)胞增殖通路,通過(guò)p38MAPK 蛋白磷酸化激活其絲裂原活化蛋白激酶,從而進(jìn)一步激活其下游的靶基因,調(diào)控成纖維細(xì)胞增生和膠原的分泌,靶向p38MAPK 通路的研究顯示可以拮抗間質(zhì)纖維化[12],王芳等[13]的研究顯示PPARγ 配體4i 可同過(guò)抑制MAPK 信號(hào)通路抑制小鼠巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,說(shuō)明了PPARγ 可以調(diào)節(jié)MAPK 信號(hào)通路,金玲等[14]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)羅格列酮可抑制p38 MAPK 信號(hào)通路中的磷酸激酶活性,阻止通路的級(jí)聯(lián)激活,進(jìn)一步拮抗乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,Nuwormegbe等[15]發(fā)現(xiàn)羅格列酮通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK 通路抑制人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的纖維化反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示HD-RGZ 組P-p38MAPK、Col I 和Col III 蛋白顯著低于LD-RGZ 組(P<0.01),LD-RGZ 組又顯著低于TGF-β1 組,說(shuō)明了RGZ 可以劑量依賴(lài)性的抑制p38MAPK 蛋白磷酸化,阻礙了p38MAPK 通路的激活,進(jìn)一步減低了成纖維細(xì)胞膠原蛋白的合成。p38 MAPK 信號(hào)通路調(diào)控激活可以刺激成纖維細(xì)胞增生,羅格列酮抑制成纖維細(xì)胞增殖可能與p38 MAPK 信號(hào)通路抑制相關(guān),但羅格列酮抑制p38 MAPK 信號(hào)通路的詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)闡明。

綜上所述,本研究顯示羅格列酮可以抑制p38MAPK 通路,從而抑制肺成纖維細(xì)胞增殖以及膠原的合成,羅格列酮是否可以用于抗肺間質(zhì)纖維化的治療還有待進(jìn)一步的臨床研究來(lái)探明。