北京市藥品檢驗(yàn)所 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（102206）李珉 侯金鳳 陸巖 車寶泉 王俊秋 李文東

卡那霉素為氨基糖苷類抗生素中具有代表性的藥物之一[1]。目前卡那霉素所有制劑的原料都是以硫酸鹽的形式存在，在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)硫酸卡那霉素分子晶體結(jié)構(gòu)中硫酸分子和結(jié)晶水分子個(gè)數(shù)的不同，存在多種不同的原料。目前各國(guó)藥典中，主要將其區(qū)分為單硫酸卡那霉素單硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·H2SO4)和硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·xH2SO4)兩種原料[2]。其中《英國(guó)藥典》2017版[3]、《歐洲藥典》9.0版[4]以及《日本藥局方》ⅩⅦ版[5]均收錄了兩種原料，《美國(guó)藥典》40版[6]僅收錄了單硫酸卡那霉素，而《中國(guó)藥典》2015年版[7]僅收錄了硫酸卡那霉素。雖然各國(guó)藥典均收錄了至少一種硫酸卡那霉素原料，但對(duì)具體晶體結(jié)構(gòu)卻都沒有說明。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，兩種原料晶體結(jié)構(gòu)具有顯著差異，且硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·xH2SO4)可能存在多種不同的晶體結(jié)構(gòu)。因此，檢查硫酸鹽含量對(duì)控制分子成鹽度具有重要意義，此外對(duì)區(qū)分單硫酸卡那霉素以及硫酸卡那霉素的不同晶型及晶體結(jié)構(gòu)研究具有一定的借鑒意義。

附表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

附表2 硫酸鹽含量測(cè)定結(jié)果

附圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖

附圖2 典型的對(duì)照品溶液及供試品溶液圖譜

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾公司），Corona Veo 電噴霧檢測(cè)器（CAD）（賽默飛世爾公司），LC-20A高效液相色譜儀（島津公司），2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）（奧泰公司），X A 2 0 5 電子天平（梅特勒-托利多公司）等。

1.2 對(duì)照品 卡那霉素對(duì)照品（批號(hào)130556-200501，含量6 6.5%）和卡那霉素B 對(duì)照品（批號(hào)130548-200501）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，硫酸滴定液（批號(hào)20161103）由北京市藥品檢驗(yàn)所配制并標(biāo)定。

1.3 試劑 三氟乙酸、甲醇均為色譜純，購(gòu)自Merck公司。

1.4 樣品 單硫酸卡那霉素原料，分別來自本溪海大制藥有限公司（企業(yè)A）和古田福興醫(yī)藥有限公司（企業(yè)B）；硫酸卡那霉素原料，來自成都倍特藥業(yè)有限公司（企業(yè)C）。

2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

2.1 HPLC-CAD條件 色譜柱：Waters HSS T3色譜柱（4.6mm×250mm,5μm）；流動(dòng)相：0.2mol/L三氟乙酸水溶液；流速：0.3mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20μL。

噴霧器溫度：3 5 ℃；采樣頻率：1Hz；輸出范圍：100pA；氮?dú)夤ぷ鳉鈮海?8.7psi。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別稱取卡那霉素對(duì)照品12.37mg，卡那霉素B對(duì)照品8.42mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。精密量取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20μL注入液相色譜儀，照“2.1”項(xiàng)下條件分析，結(jié)果見附圖1。

硫酸根離子峰與卡那霉素峰分離度達(dá)到10.55，卡那霉素峰與卡那霉素B峰分離度達(dá)到6.65，硫酸根離子峰理論塔板數(shù)為5432，滿足分析要求。

2.4 檢出限與定量限 量取硫酸滴定液適量，加水溶解并逐級(jí)稀釋得系列稀釋溶液，按信噪比為3∶1測(cè)定檢測(cè)限為0.02μg，按信噪比10∶1測(cè)定定量限為0.04μg。

2.6 進(jìn)樣精密度 精密量取硫酸滴定液0.8ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為硫酸鹽進(jìn)樣精密度試驗(yàn)。取“2.4項(xiàng)”下硫酸鹽進(jìn)樣精密度溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算，RSD為0.6%，進(jìn)樣精密度良好。

2.7 重復(fù)性 取批號(hào)為（20120112-1）樣品，分別精密稱取6份，分別照硫酸鹽測(cè)定方法，分別進(jìn)樣，測(cè)定其硫酸鹽含量，結(jié)果的RSD為0.8%。

附圖3 硫酸鹽（SO42-）對(duì)照溶液、亞硫酸鹽（SO32-）對(duì)照溶液以及硫酸卡那霉素注射液供試品溶液圖譜

2.8 回收率 取批號(hào)為20120112-1的樣品約12.5mg，置50mL量瓶中，加入硫酸滴定液0.4mL，重復(fù)配制6份，作為硫酸鹽回收率試驗(yàn)溶液。計(jì)算回收率結(jié)果見附表1，結(jié)果滿足硫酸鹽分析要求。

2.9 硫酸鹽測(cè)定 分別取批號(hào)為20120112-1、20120203-1、D1405020和D1405022的單硫酸卡那霉素原料樣品以及批號(hào)為100701、130701和131001的硫酸卡那霉素原料樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液及對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下條件分析。典型的對(duì)照品溶液及供試品溶液代表圖譜，詳見附圖2。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算硫酸鹽含量，結(jié)果見附表2。

3 討論

由硫酸鹽測(cè)定結(jié)果可以看出，單硫酸卡那霉素與硫酸卡那霉素兩種原料所含硫酸鹽含量顯著不同。目前《中國(guó)藥典》2015年版中收載了硫酸卡那霉素原料，其硫酸鹽含量的限度為按干燥品計(jì)算的23.0%～26.0%，《美國(guó)藥典》40版中收載了單硫酸卡那霉素，其硫酸鹽含量的限度為按干燥品計(jì)算的15.0%～17.0%。采用建立的HPLCCAD法，兩種原料藥測(cè)定結(jié)果分別在15.0%～17.0%和23.0%～26.0%范圍內(nèi)，這也從側(cè)面印證了兩種原料具有不同的分子組成，為兩個(gè)不同的藥品品種。

綜上所述，本文建立了用于測(cè)定硫酸卡那霉素原料藥中硫酸鹽含量的HPLC-

CAD法，以代替現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的容量滴定法。高效液相色譜法相較容量滴定法具有專屬性強(qiáng)、分離度高的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，CAD檢測(cè)器可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)紫外檢測(cè)器對(duì)硫酸鹽測(cè)定不適用的問題。新建的HPLC-CAD法結(jié)合了專屬性強(qiáng)的分離能力以及靈敏度高的檢測(cè)能力，可以更有效地進(jìn)行硫酸鹽測(cè)定。此外，新建的HPLC-CAD法還具有用于其他氨基糖苷類抗生素原料藥中硫酸鹽含量測(cè)定的潛力。