陳茂霞 常佳麗 衛(wèi)詩倩 鄒家尉 楊 娟

(樂山師范學院 化學與資源環(huán)境學院，四川 樂山 614000)

現(xiàn)代市政污水中抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)是被廣泛認可的生物污染物。其中，四環(huán)素抗生素抗性(tetracycline resistance genes，tet)、β-內(nèi)酰胺抗性基因(beta-lactam resistance genes，bla)、大環(huán)內(nèi)酯抗性基因(macrolide resistance genes，erm)、喹諾酮抗性基因(quinolone resistance genes，qnr)、和磺胺類抗性基因(sulfonamide resistance genes，sul)是污水處理系統(tǒng)中最為常見的ARGs。1類整合子的整合酶基因(Integrase genes of class 1 integrons，intl1)是其中典型的可移動遺傳因子(mobile genetic elements，MGEs)，與ARGs在污水生物處理過程中產(chǎn)生的基因水平轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer，HGT)密切相關(guān)[1]。其隨廢水進入污水處理廠后可被部分去除，但最終出水中仍然會有殘余，隨出水排放至環(huán)境會造成生態(tài)環(huán)境中ARGs升高[2-3]?；诖?，污水處理廠的中水回用、出水灌溉等直接利用是存在風險的[4-5]。

研究者們發(fā)現(xiàn)污水處理廠中ARGs的去除可發(fā)生在生物反應(yīng)單元、物理過濾單元和消毒單元[6-8]。大量相關(guān)研究使污水處理廠中ARGs去除機理逐漸清晰[9]：ARGs包括抗生素抗性菌(antibiotic resistant bacteria，ARB)攜帶的胞內(nèi)基因和游離基因。ARB同化污水中營養(yǎng)物質(zhì)，在適宜的條件下進行生長、增殖，導致胞內(nèi)ARG得到復制。同時污水中抗生素的存在可提供選擇壓力，誘導不具備抗生素抗性的微生物產(chǎn)生ARGs。ARB之間還可發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT)，攜帶ARGs的ARB可將ARGs轉(zhuǎn)移至其他微生物。微生物死亡后釋放部分游離ARGs。游離ARGs可被微生物吸附、吸收和降解。

然而，同樣的處理單元，ARGs在有些報道中表現(xiàn)出去除趨勢，但也有出水中ARGs高于進水的報道。如同樣采用好氧工藝，Christgen等發(fā)現(xiàn)低耗能厭氧-好氧處理反應(yīng)器可降低生活污水中ARGs[10]，然而Du等報道A2/O-MBR工藝處理市政污水中好氧池內(nèi)ARGs卻有所上升[11]。又如，同樣采用紫外消毒，Li等的研究表明污水處理廠中紫外消毒處理不能明顯降低ARGs[12]，但Su等在考察市政污水處理廠中ARGs變化時發(fā)現(xiàn)紫外消毒和加氯消毒可通過降低水細菌的數(shù)量顯著降低ARGs絕對豐度[13]。這種去除效果的不確定性與廢水性質(zhì)、操作條件、ARGs類型等因素有關(guān)[9]。要盡量降低污水處理廠出水中ARGs的豐度，明確相同的處理工藝卻有不同的ARGs去除效果的原因是有必要的。因此，本文選取了兩個接收同一個城市市政污水的污水處理廠作為研究對象，盡量減小廢水性質(zhì)對ARGs去除的影響，考察該兩座污水處理廠在采用不同處理工藝的情況下典型ARGs的變化。

1 材料與方法

1.1 污水處理廠及取樣點

本研究選取位于四川的兩個污水處理廠，分別接受同一個城市的市政污水。污水處理廠1#和2#處理規(guī)模(100%)分別為8 000 m3/d和10 000 m3/d，分別采用“缺氧-好氧”工藝和“周期循環(huán)活性污泥法(Cyclic Activated Sludge System，CASS)+纖維轉(zhuǎn)盤濾池(Fiber turntable filter，F(xiàn)TF)”工藝(圖1)。

圖1 兩個污水處理廠工藝流程及取樣點注：空心三角形表明直接取水樣；實心三角形表明取混合液(水和活性污泥充分混合，靜置30 min后取上清液)。

采用經(jīng)75%酒精和無菌水洗滌后塑料容器進行取樣。所取樣品如圖1所示，包括1#污水處理廠中進水、缺氧池末端水樣、好氧池末端水樣、最終出水以及2#污水處理廠中進水、CASS末端水樣、纖維轉(zhuǎn)盤濾池出水、最終出水。其中，1#污水處理廠為連續(xù)運行，缺氧池和好氧池樣品均取自池體水流末端，2#污水處理廠為間歇運行，CASS池中的樣品為曝氣(含同時進水0.5 h)3 h后樣品。每個取樣點分別取3個平行樣。所有樣品取樣后2 h內(nèi)送至實驗室進行過濾。將所取水樣搖勻，取250 ml，采用孔徑0.25 μm聚碳酸酯濾膜進行抽濾。抽濾后濾膜用于DNA提取，提取后的DNA保存于-20℃。

1.2 DNA提取與qPCR

DNA提取采用土壤DNA快速提取試劑盒(SK8233，生工)。采用分光光度計(NanoDrop 2000，Thermo Scientic)檢測提取后的DNA濃度和質(zhì)量，并置于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 0.5 μl；引物 F(10μM)0.5 μl；引物 R(10 μM)0.5 μl；dNTP(10 mM)0.5 μl；Taq緩沖液(10×)2.5 μl；MgCl2(25 mM)2 μl；Taq酶(5U/μl)0.2 μl；H2O 18.3 μl。PCR反應(yīng)條件：預變性 95℃ 3 min；變性 94℃ 30s；退火 57℃ 30s；延伸 72℃30s；修復延伸 72℃ 8 min；循環(huán)35次。本研究涉及的ARGs引物如表1所示。

表1 抗生素抗性基因引物表

1.3 常規(guī)污染物分析方法

氨氮、TP分別采用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009)和鉬酸銨比色法(GB 11893-1989)測定，COD采用重鉻酸鉀法(GB 11914-1989)測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

目標基因的絕對豐度表征每毫升水樣中基因拷貝數(shù)，相對豐度為水樣中基因拷貝數(shù)與16S rDNA基因拷貝數(shù)的比值。本文數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2010軟件，相關(guān)性分析和除趨勢對應(yīng)分析(Detrended correspondence analysis，DCA)采用Canoco軟件(5.0版本)進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 常規(guī)污染物去除

兩個污水處理廠的進水水質(zhì)相似，且生物處理單元對常規(guī)污染物的去除效果較好(圖2)。進水氨氮、COD、TP濃度與其他報道中市政污水處理廠進水水質(zhì)相似[20-21]。

圖2 污水處理廠中常規(guī)污染物的去除效果

從圖2(A)中看出，1#污水處理廠中，污水進入缺氧池后，盡管缺氧條件下硝化作用不能很好地進行，但氨氮通過大量回流稀釋作用從進水中的37.53 mg/L降至10.31 mg/L。進入好氧池后，氨氮在好氧條件下進一步降至1.64 mg/L。污水進入缺氧池后，有機物迅速被活性污泥吸附，同時由于稀釋作用，COD從進水中106.29 mg/L降至48.04 mg/L?？梢姡撐鬯幚韽S中氨氮主要通過好氧池內(nèi)的硝化作用被去除，COD主要通過缺氧池和好氧池內(nèi)的污泥吸附、利用和降解得到去除。

從圖2(B)可以看出，2#污水處理廠的氨氮去除主要發(fā)生在CASS反應(yīng)池內(nèi)，曝氣3 h后，池內(nèi)氨氮降至3.64 mg/L，去除率達91.61%。同樣地，污水進入CASS池后，COD降至73.24 mg/L；曝氣、沉淀結(jié)束后的出水經(jīng)過FTF處理單元后，下降至49.00 mg/L。FTF是以纖維毛濾布作為過濾介質(zhì)的轉(zhuǎn)盤式過濾裝置，具有可連續(xù)運行，占地面積小，適用于不同水頭、不同負荷的優(yōu)點。直接使用對污水中SS具有明顯去除效果，結(jié)合藥劑使用還可實現(xiàn)TP和COD的去除，通常作為深度處理和提標改造的加強單元[22]。

因此，本研究中兩個污水處理廠的主要常規(guī)污染物去除效果較好。出水氨氮、COD均達到該兩個污水處理廠要求的《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》(GB 18918-2002)一級A標中的限值(分別為5 mg/L和50 mg/L)。但是，1#和2#兩個系統(tǒng)內(nèi)雖然TP進水濃度均不高，但出水TP分別為1.3 mg/L和0.57 mg/L，未能達到前述標準。

2.2 ARGs絕對豐度變化

本研究涉及的六個ARGs在1#和2#污水處理廠的進水均有檢出，ARGs絕對豐度的范圍分別是1.51×104～9.54×106copies/mL和2.97×104～6.93×106copies/mL(圖3)，與其他研究中豬場廢水、城市廢水、制藥廢水的數(shù)量級范圍相當[23-25]。其中，兩個污水處理廠進水中，絕對豐度最高的均為intl1，其次為sul1、tetX，qnrS最低，且同樣的ARGs在兩個污水處理廠的進水中的數(shù)量級相同。關(guān)于污水處理系統(tǒng)ARGs分布的其他研究中，通常發(fā)現(xiàn)intl1、磺胺類抗性基因(sul)和四環(huán)素抗性基因(tet)在進水中是主要的ARGs，這和本研究得出的結(jié)果相吻合[11,13,26]。

圖3 污水處理廠中ARGs絕對豐度變化 (A、B圖為1#污水處理廠，C、D圖為 2#污水處理廠)

從圖3(A)、(C)可以看出，兩個污水處理廠的進水中ARGs的含量和分布均存在相似性。Mao D等在研究中國北方某地的兩個市政污水處理廠中ARGs變化時發(fā)現(xiàn)涉及的30個ARGs絕對豐度在104～107copies/mL范圍內(nèi)，相同基因在不同污水處理廠進水中的絕對豐度水平在同一數(shù)量級，表明了兩個污水處理廠進水ARGs分布的相似性，與本研究結(jié)果一致[27]。

從圖3(A)、(B)可以看出，1#污水處理廠進水進入缺氧池后，ARGs絕對豐度顯著下降。池中水相ARGs相比進水而言，ARGs相對豐度下降了(1.5±0.20) (平均值±標準偏差)個數(shù)量級，去除率達到96.51%±1.74%，其中blaTEM去除率最高，達到97.83%。污水從缺氧池進入好氧池后，好氧池末端水相ARGs絕對豐度相比缺氧池下降了(1.65±0.15)個數(shù)量級，去除率達到97.62%±0.91%?？梢?，缺氧池和好氧池對污水中ARGs的去除效果均非常顯著。 經(jīng)過生物處理單元(缺氧池+好氧池)后，污水中的tetX、qnrS、blaTEM、ermB降至100～101copies/mL范圍內(nèi)，可忽略不計；sul1和intl1絕對豐度分別降至103～104copies/mL。該污水處理廠中生物處理單元可使污水中ARGs絕對豐度降低(3.14±0.32)個數(shù)量級。Szekeres等發(fā)現(xiàn)污水處理單元可降低醫(yī)療廢水中ARGs相對豐度1～3個數(shù)量級[28]，Mcconnell等發(fā)現(xiàn)好氧塘工藝和生物脫氮系統(tǒng)可分別降低ARGs相對豐度1.77和1.69個數(shù)量級[29]。污水進一步經(jīng)過二沉池、紫外消毒后，最終出水ARGs水平與前述水平相當，說明二沉池和紫外消毒對生物處理單元出水中殘留較高的sul1和intl1基因去除效果不明顯。前期有研究發(fā)現(xiàn)，紫外消毒對ARGs的去除效果非常有限[30-31]。因此，想要通過消毒環(huán)節(jié)進一步降低ARGs，減少最終出水中ARGs的排放，紫外消毒不是理想的消毒方式。

與1#污水處理廠相似，2#污水處理廠進水ARGs經(jīng)過CASS池后得到明顯去除，水相ARGs相比進水下降了(1.05±0.16)個數(shù)量級，去除率為90.69%±3.15%，其中qnrS具有最高去除率，為94.50%(見圖3[C][D])。該污水處理廠中CASS池相比ARGs去除效果相比1#生物處理單元更低。曝氣結(jié)束后，經(jīng)過1 h沉淀，CASS池出水進入FTF處理單元進行過濾。FTF對CASS處理出水中ARGs進行有效的去除，ARGs絕對相比CASS池下降了(0.04±0.45)個數(shù)量級，去除率達98.68%±1.00%。 有研究發(fā)現(xiàn)，污水生物處理結(jié)束后進一步采用表面介質(zhì)過濾(無煙煤/砂/礫石)或生物處理結(jié)合膜組件過濾(MBR)，均可顯著降低污水中ARGs，減少ARGs出水外排。與1#污水處理廠中得出的結(jié)果相似，紫外消毒作為出水前最后一道工序，對FTF出水中殘留ARGs去除效果不明顯。

兩個污水處理廠進水中大量的ARGs進入處理環(huán)節(jié)后，在生物處理單元得到明顯去除，但出水中檢出較高sul1和intl1殘留，其中2#污水處理廠(CASS+纖維轉(zhuǎn)盤濾池)出水中上述殘留ARGs絕對豐度(分別為6.77×102copies/mL和6.85×103copies/mL)比1#(缺氧+好氧)(分別為2.28×103copies/mL和1.24×104copies/mL)低。因此，出水中ARGs排放對環(huán)境可能造成的影響不可忽視。

2.3 ARGs相對豐度變化

污水處理廠1#和2#中ARGs相對豐度分別為1.21×10-5～7.65×10-3和2.71×10-5～6.32×10-3(圖4)。污水進入污水處理單元后，ARGs相對豐度總體均有所下降，但不同處理單元間變化卻不明顯。其他的研究中也發(fā)現(xiàn)，污水在處理單元中絕對豐度的去除效果明顯，但相對豐度卻表現(xiàn)出更多不確定性[32]。如Caucci等發(fā)現(xiàn)污水處理前后，ARGs的相對豐度沒有明顯變化[33]；Guo X等的研究中出水ARGs的相對豐度是進水中的0%～577%，波動較大[34]。

圖4 污水處理廠中ARGs相對豐度變化(A、B圖為1#污水處理廠，C、D圖為 2#污水處理廠)

近年有研究表明，污水處理運行條件和環(huán)境因子，如溶解氧(DO)、污泥停留時間(SRT)、鹽度、重金屬離子等，對ARGs的相對豐度具有影響[9]。如Ma Z發(fā)現(xiàn)長期低DO條件運行豬場廢水處理系統(tǒng)，可以降低系統(tǒng)內(nèi)ARGs的相對豐度，機理是增加了活性污泥中的總16S rDNA同時抑制了ARGs的增殖[35]。Junya Z等報道了采用A2/O工藝的污水處理廠提高SRT會增加ARGs的相對豐度，但是卻會減少出水中的ARGs絕對豐度[36]。

結(jié)合2.2節(jié)中數(shù)據(jù)表明，本研究中兩個污水處理廠對ARGs的絕對豐度具有明顯的去除效果，但對ARGs的相對豐度并沒有顯著的影響。

2.4 常規(guī)污染物與ARGs的相關(guān)性

如圖5所示，本研究分析了常規(guī)污染物(氨氮、TP、COD)和ARGs(絕對豐度和相對豐度)在污水處理過程中去除規(guī)律的相關(guān)性，以期為常規(guī)污染物和ARGs去除協(xié)同調(diào)控提供參考。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常規(guī)污染物指標之間為正相關(guān)(R=0.5317±0.2628)，這是由于三種污染物主要去除單元相似。常規(guī)污染物指標與ARGs絕對豐度之間相關(guān)性不明顯(R=-0.3743±0.5174)，但與ARGs相對豐度之間正相關(guān)(R=0.6627±0.3280)，其中COD、TP分別與ARGs相對豐度間相關(guān)性明顯(R分別為0.9246±0.0316和0.8452±0.0669)。Mailis等在研究廢水類型對傳統(tǒng)污水處理廠中ARGs變化時發(fā)現(xiàn)，如BOD、TP、TN等常規(guī)污染物指標與ARGs相對豐度的相關(guān)性不大[37]。相反地，Qing-Bin Y在研究豬場廢水處理過程中ARGs與重金屬、廢水水質(zhì)相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，ARGs與廢水的營養(yǎng)具有正相關(guān)[38]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TP、COD與ARGs相對豐度間明顯正相關(guān)，表明常規(guī)污染物的有效去除可能對ARGs相對豐度控制具有促進作用。

(A)相關(guān)系數(shù)圖表

(B)DCA分析圖圖5 污水處理廠中常規(guī)污染物與ARGs的相關(guān)性

另外，ARGs絕對豐度之間、ARGs絕對豐度與相對豐度之間相關(guān)性不明顯，ARGs相對豐度之間從數(shù)據(jù)上呈顯著正相關(guān)(R=0.9444±0.0350)，表明各ARGs相對豐度的變化具有關(guān)聯(lián)性，不同ARGs之間相對豐度的調(diào)控有望協(xié)同進行。從單個基因看，qnrS的絕對豐度和ermB的絕對豐度正相關(guān)(R=0.9524)，qnrS相對豐度與ermB相對豐度正相關(guān)(R=0.9762)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，污水處理過程中不同種類ARGs之間會出現(xiàn)顯著相關(guān)性，這與ARGs的去除機理有關(guān)，如四環(huán)素的去除機制主要是通過污泥吸附，磺胺類抗生素則主要是由于生物降解而減少，這會直接影響tet類和sul類ARGs基因的去除[39]。

如圖5(B)所示，DCA圖展示了本研究各指標之間簡明的相關(guān)性，表明常規(guī)污染物指標和ARGs指標主要被分為ARGs絕對豐度和ARGs相對豐度兩個組。其中，氨氮與ARGs絕對豐度的相關(guān)性高于TP和COD；COD相比氨氮和TP而言與ARGs相對豐度更相關(guān)。

3 結(jié)論

兩個接收同一城市污水的市政污水處理廠中，進水水質(zhì)指標中不僅常規(guī)污染物濃度相似，其涉及的ARGs絕對豐度和相對豐度均相似。污水處理廠可使污水中ARGs絕對豐度下降99.74%以上，但對ARGs相對豐度卻沒有明顯的影響。盡管污水中大部分ARGs可被去除，但出水中仍有大量ARGs被檢出，其隨出水源源不斷地排放對生態(tài)環(huán)境造成的生物污染不可忽視。另外，在盡量降低兩個污水處理廠進水水質(zhì)干擾的條件下，本研究發(fā)現(xiàn)污水中ARGs的去除主要發(fā)生在生物處理單元，生物處理后的過濾環(huán)節(jié)可對ARGs進行進一步有效去除，但出水前的紫外消毒對ARGs去除作用不明顯。為了降低污水處理廠出水中ARGs排放，建議在生物處理單元后加強SS的去除，并采用加氯消毒方式用于出水前微生物滅活。