,＊

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法，具有準(zhǔn)確性高、特異性好、試驗(yàn)過程簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[1-2]。熒光定量試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性取決于特定引物的擴(kuò)增效率、cDNA的純度以及內(nèi)參基因的穩(wěn)定性等，穩(wěn)定的內(nèi)參基因能夠使目的基因的定量分析結(jié)果準(zhǔn)確、特異性好[3-4]。在不同植物間或同一植物不同組織部位間內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性有一定差異，通常會(huì)選擇在植物生命活動(dòng)全過程或外界環(huán)境變化時(shí)都能表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定、受環(huán)境影響較小的管家基因(Housekeeper gene)，如肌動(dòng)蛋白(Actin)、泛素蛋白(Ubiquitin)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等[5-6]。

福建柏（Fokienia hodginsii（Dunn）Henry et Thomas）為柏科福建柏屬，為我國特有種屬，分布在福建、廣東、云南、廣西等我國南部省份[7]；其樹干通直、樹型優(yōu)美、四季常青、適應(yīng)性強(qiáng)、抗性較好、材性穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)細(xì)膩，是我國優(yōu)良的材用-景觀兩用型樹種之一。不僅如此，福建柏精油中含有多種藥用、化工價(jià)值的成分，開發(fā)利用價(jià)值高[8]。但福建柏的研究集中于混交造林、成分分析等方面，隨著研究的深入，分子生物學(xué)研究必不可少，如功能基因、轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析等研究，均涉及到使用熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)情況。本研究從福建柏轉(zhuǎn)錄組中選擇了8 個(gè)管家基因作為候選內(nèi)參基因，包括肌動(dòng)蛋白-7（Actin-7，ACT7）、泛素蛋白（Ubiquitin，UBQ）、延長(zhǎng)因子-2（Elongation factor-2，EF2）、氯氰菊酯配合物（Clathrin adaptor complexes，CACs）、類Tip41 家族蛋白（Tip41-like family protein，TIP41）、泛素結(jié)合酶E2（Ubiquitin-conjugating enzyme E2，UBC2b）、讀框螺旋酶-8（READ box helicase 8，RH8）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。通過qRT-PCR試驗(yàn)并結(jié)合geNorm、Normfinder 和Bestkeeper 軟件進(jìn)行分析，篩選出穩(wěn)定性強(qiáng)的內(nèi)參基因。選擇4 個(gè)福建柏萜類合成酶基因（FhTPS）作為目的基因，萜類化合物作為福建柏精油及揮發(fā)性氣體中的主要成分之一，而萜類合成酶基因?yàn)檩祁惡铣赏緩街械年P(guān)鍵酶基因，具有重要的研究意義[9]。利用目的基因在福建柏不同組織部位的相對(duì)表達(dá)水平及模式來驗(yàn)證篩選出的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，為后續(xù)福建柏RT-qPCR 試驗(yàn)的準(zhǔn)確性、科學(xué)性提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為20 年生生長(zhǎng)良好、無病蟲害的福建柏鱗葉、樹皮和根，于2019 年8 月采集于福建省福州市永泰縣大湖國有林場(chǎng)的福建柏天然林，使用無菌水把材料清洗干凈并用無菌濾紙擦干后，用錫箔紙包裹立即放進(jìn)干冰中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于?80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ谕粎^(qū)塊內(nèi)取3 棵樹齡相近、長(zhǎng)勢(shì)一致的福建柏的鱗葉、樹皮和根分別設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)用于總RNA 提取、定量分析等試驗(yàn)。針對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，按以上方式單獨(dú)采集了植物各部位材料的3 次生物學(xué)重復(fù)用于測(cè)序。

1.2 主要試劑與儀器

總RNA 提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green Premix Ex TaqII 購于TaKaRa 公司；qRT-PCR 儀為Applied BiosystemsTM7500；分光光度儀為NanoDrop 2000。

1.3 方法

1.3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、總RNA 的提取與cDNA 第一條鏈的合成 將采集回來的福建柏根、皮和鱗葉3 個(gè)組織部位的植物材料立即送往武漢邁特維爾生物科技有限公司進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。按照總RNA提取試劑盒說明書和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟分別提取福建柏3 個(gè)組織部位的總RNA，并進(jìn)行濃度測(cè)定和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一條鏈。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與特異性檢測(cè) 從福建柏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出表達(dá)量高、表達(dá)穩(wěn)定的TPS基因部分片段，經(jīng)過NCBI-Blast 比對(duì)后將匹配的TPS基因用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)4 個(gè)FhTPS基因的RTqPCR 引物，同時(shí)篩選并設(shè)計(jì)福建柏8 個(gè)候選內(nèi)參基因（ACT7、UBQ、EF2、CACs、TIP41、UBC2b、RH8、GAPDH）的引物（表1），引物由福州鉑尚測(cè)序公司提供。將設(shè)計(jì)好的引物用TB Green 試劑盒進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)特異性（即是否產(chǎn)生二聚體），檢測(cè)中模板用ddH2O 代替，分析各引物的溶解曲線和高表達(dá)擴(kuò)增情況。

表1 福建柏內(nèi)參基因及TPS 基因引物Table 1 Primer of reference genes and TPS genes of Fokienia hodginsii

1.3.3 內(nèi)參基因篩選和FhTPS基因定量表達(dá)分析將福建柏根、樹皮和鱗葉反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 稀釋至200 ng·μL?1，設(shè)置5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，以5倍濃度稀釋，得到200、40、8、1.6、0.32 ng·μL?15 個(gè)質(zhì)量濃度的cDNA 樣品。把各質(zhì)量濃度3 個(gè)組織部位稀釋好的cDNA 混合至一個(gè)離心管中，充分混勻后以此為模板。將8 個(gè)候選基因4 個(gè)FhTPS基因用TB Green 試劑盒進(jìn)行RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系TB Green Premix Ex Taq 10 μL，正反引物各0.8 μL，RoxII 0.4 μL，ddH2O 6 μL。在內(nèi)參基因篩選中按照5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度作為cDNA 的質(zhì)量濃度，在FhTPS基因進(jìn)行驗(yàn)證定量分析中按照TB Green試劑盒說明書要求以100 ng·μL?1作為cDNA 的質(zhì)量濃度。擴(kuò)增程序：95℃反應(yīng)30 s；95℃反應(yīng)5 s，60℃反應(yīng)34 s，共40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95℃反應(yīng)15 s，60℃反應(yīng)1 min，95℃反應(yīng)15 s。每個(gè)候選內(nèi)參基因在不同部位和不同濃度均設(shè)置4 個(gè)重復(fù)，后用Ct(2?ΔΔCT)法計(jì)算8 個(gè)候選內(nèi)參基因和4 個(gè)FhTPS基因在福建柏根、皮和鱗葉中的相對(duì)表達(dá)量。1.3.4 數(shù)據(jù)處理 利用3 個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)軟件geNorm[10]、Normfinder[11]和BestKeeper[12]，對(duì)8 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出適合于福建柏各組織的穩(wěn)定內(nèi)參基因及組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄本的拼接和總RNA 的提取

由測(cè)序得到的福建柏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，通過拼接得到330 521 條轉(zhuǎn)錄本序列，平均長(zhǎng)度為721 bp，可用于后續(xù)分析使用。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 質(zhì)量，檢測(cè)結(jié)果條帶清晰，28S rRNA比18S rRNA 條帶更亮。同時(shí)利用分光光度儀進(jìn)行純度檢測(cè)，結(jié)果顯示：A260/A280比值均在1.8～2.0之間。因此，可以說明RNA 無降解、完整性良好（圖1）。

2.2 引物驗(yàn)證

通過RT-qPCR 的擴(kuò)增，結(jié)果顯示：8 個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率為98.32%～104.79%，相關(guān)系數(shù)R2為0.973～0.999，符合內(nèi)參基因的初步要求,可進(jìn)行進(jìn)一步反應(yīng)；而且8 個(gè)候選內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線均為單一峰, 特異性較好, 熔解溫度(Tm)均在80～90℃之間, 可用于進(jìn)一步分析（圖2）。

2.3 候選內(nèi)參基因Ct 值分析

從RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)獲得的各候選內(nèi)參基因Ct值與其表達(dá)豐度成反比，Ct值越大，基因表達(dá)量越低[13]。結(jié)果（圖3）顯示：從5 個(gè)質(zhì)量濃度的Ct值綜合分析，所選擇的8 個(gè)候選內(nèi)參基因的平均值最低的為UBC2b（24.40），平均值最高的為UBQ（31.25）。從各質(zhì)量濃度單獨(dú)分析，從高濃度至低濃度過渡時(shí)，Ct值均逐漸增大，符合表達(dá)規(guī)律。而且5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度下各候選內(nèi)參基因的平均Ct值大小規(guī)律一致，說明試驗(yàn)誤差較小。UBQ在各質(zhì)量濃度下Ct值明顯高于其他7 個(gè)候選內(nèi)參基因，不適合作為內(nèi)參基因來檢測(cè)高豐度基因的表達(dá)情況。

圖1 總RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Total RNA agarose gel electrophoresis

2.4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.4.1 geNorm 軟件分析 geNorm 軟件是通過計(jì)算候選內(nèi)參基因的平均穩(wěn)定指數(shù)M 值來對(duì)比候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，M = 1.5 為穩(wěn)定性分界線，當(dāng)M 值低于1.5 時(shí)，可判定該候選內(nèi)參基因較穩(wěn)定，且M 值越低，該內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越高[14]。軟件分析結(jié)果表明：在各處理中，8 個(gè)候選內(nèi)參基因M 值均低于1.5，說明候選內(nèi)參基因的表達(dá)均較穩(wěn)定。表2 可知：在5 個(gè)質(zhì)量濃度下，M 值最小的均為ACT7。在質(zhì)量濃度為8、200 ng·μL?1時(shí)，RH8的M 值最大；在質(zhì)量濃度為1.6、40 ng·μL?1時(shí)，DAPDH的M 值最大；在質(zhì)量濃度為0.32 ng·μL?1時(shí)，TIP41的M 值最大。說明ACT7在geNorm 軟件分析下的穩(wěn)定性最好，而RH8和DAPDH的穩(wěn)定性較差。

在geNorm 軟件分析中，標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析（Vn/Vn+1）是對(duì)候選內(nèi)參基因最佳配對(duì)數(shù)目的衡量。當(dāng)Vn/Vn+1=0.15 為分界值，若Vn/Vn+1小于該數(shù)值說明n個(gè)內(nèi)參基因可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定歸一化[10]。結(jié)果（圖4）表明：V2/V3、V3/V4、V4/V5、V6/V7均小于0.15，說明在n=2 時(shí)已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定歸一化，即2 個(gè)穩(wěn)定內(nèi)參基因的組合可以使定量結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。

圖2 候選內(nèi)參基因溶解曲線Fig.2 Melting curves of the candidate reference genes

圖3 5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度福建柏組織混樣的cDNA 下候選基因Ct 值Fig.3 The cycle threshold values of candidate reference genes in 5 mass concentrations of cDNA mixture

2.4.2 Normfinder 軟件分析 利用Normfinder 軟件分析8 個(gè)候選內(nèi)參基因得到候選內(nèi)參基因的M值，根據(jù)M 值越低基因表達(dá)越穩(wěn)定的原則對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行比較。軟件分析結(jié)果（表3）表明：8 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序在5 個(gè)質(zhì)量濃度下各有不同，在質(zhì)量濃度為0.32 ng·μL?1時(shí)，表達(dá)穩(wěn)定性較好的是RH8、CACs和ACT7，穩(wěn)定性較差的是TIP41；在質(zhì)量濃度為1.6、8 ng·μL?1時(shí)，表達(dá)穩(wěn)定性較好的均為ACT7、UBC2b，穩(wěn)定性較差的分別是DAPDH和RH8；在質(zhì)量濃度為40 ng·μL?1時(shí)，表達(dá)穩(wěn)定性較好的是EF2和UBC2b，穩(wěn)定性較差的是DAPDH；在質(zhì)量濃度為200 ng·μL?1時(shí)表達(dá)穩(wěn)定性較好的是TIP41和ACT7，穩(wěn)定性較差的是RH8。

2.4.3 BestKeeper 軟件分析 BestKeeper 軟件可以通過計(jì)算每個(gè)基因直接產(chǎn)生配對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）、變異系數(shù)（CV）和相關(guān)系數(shù)變量（r）來評(píng)價(jià)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。表達(dá)穩(wěn)定性好的基因一般呈現(xiàn)較高的r值、較小的SD和CV[14]。此外，當(dāng)SD值大于1 時(shí)則表明基因的表達(dá)不穩(wěn)定[13]。結(jié)果（表4）顯示：在5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度下，SD值和CV值較小的均為UBC2b、EF2和ACT7，其中，3 個(gè)候選內(nèi)參基因的SD值均小于0.1，CV值均小于0.4；而5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度下的r值排序差異較大，其中，r值較大的為TIP41和ACT7，較小的為UBC2b。將5 個(gè)質(zhì)量濃度下的SD、CV和r進(jìn)行綜合排序，穩(wěn)定性較好的為UBC2b、ACT7和EF2，穩(wěn)定性較差的為DAPDH和RH8。

表2 geNorm 軟件分析不同cDNA 質(zhì)量濃度下候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Table 2 Stability analysis of candidate reference genes of in different mass concentrations of cDNA by geNorm

圖4 geNorm 軟件分析內(nèi)參基因最適數(shù)目Fig.4 Analysis of optial number of reference genes for normalization by geNorm

2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

根據(jù)3 個(gè)分析軟件得出的結(jié)果，選擇穩(wěn)定性較好的2 個(gè)基因（ACT7和UBC2b）進(jìn)行驗(yàn)證，以穩(wěn)定性較差的RH8基因作為對(duì)照，同時(shí)利用4 個(gè)FhTPS基因驗(yàn)證內(nèi)參基因在福建柏根、樹皮、鱗葉3 個(gè)不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果（圖5）顯示：4 個(gè)FhTPS基因在福建柏的根、樹皮、鱗葉3 個(gè)不同組織的相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)一致，符合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中FPKM（Reads Per Kilobase per Million）值中的變化規(guī)律，從而驗(yàn)證了FhTPS基因能夠在福建柏3 個(gè)組織部位中穩(wěn)定表達(dá)。4 個(gè)基因在以ACT7和UBC2b作為內(nèi)參基因時(shí)，表達(dá)趨勢(shì)一致且穩(wěn)定，驗(yàn)證了ACT7和UBC2b有較好的穩(wěn)定性，2 個(gè)作為組合進(jìn)行基因表達(dá)量分析時(shí)能夠相互印證，增加定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。以RH8為內(nèi)參基因時(shí)，4 個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)波動(dòng)較大，驗(yàn)證了RH8穩(wěn)定性較差。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是基因表達(dá)分析研究中的重要技術(shù)之一，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性會(huì)受試驗(yàn)中各因素影響，其中，一個(gè)重要因素是內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，才能確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[15]；而內(nèi)參基因的穩(wěn)定性是相對(duì)的，不

表3 Normfinder 軟件分析不同cDNA 質(zhì)量濃度下候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Table 3 Stability analysis of candidate reference genes of in different mass concentrations of cDNA by Normfinder

同植物、不同組織部位、不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同試驗(yàn)條件均會(huì)影響內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[16]。如Actin基因在核桃[17]中為理想的內(nèi)參基因，而在劍麻[18]中表現(xiàn)不穩(wěn)定；在多花蘭的花器官中的理想內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，營(yíng)養(yǎng)器官中則為28SrRNA[19]；在川續(xù)斷根的不同生長(zhǎng)時(shí)期，篩選出的理想內(nèi)參基因均不相同[20]；玉米在多種非生物脅迫和不同激素處理下的理想內(nèi)參基因均有所差異[21]。由此可知，在進(jìn)行熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)前，針對(duì)不同試驗(yàn)材料、試驗(yàn)條件等因素進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選是有必要的。

表4 BestKeeper 軟件分析不同cDNA 質(zhì)量濃度下候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Table 4 Stability analysis of candidate reference genesin different mass concentrations of cDNA by BestKeeper

理想的內(nèi)參基因在同一植物所有組織中均表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定且受內(nèi)外因素影響較小，一般為細(xì)胞骨架的基本組成或參與生物體基本代謝調(diào)控過程的管家基因，如編碼細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白的Actin、TUB和TUA等基因[22]；編碼糖酵解、糖異生及光合作用碳固定循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶GAPDH基因[23]；標(biāo)記待分解蛋白、跨膜蛋白的泛素UBC、UBQ基因等等[24]。本研究根據(jù)前人研究報(bào)道的常用內(nèi)參基因，在福建柏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中選擇8 個(gè)候選內(nèi)參基因，（ACT7、UBQ、EF2、CACs、TIP41、UBC2b、RH8、GAPDH），利用GeNorm、Normfinder 和BestKeeper軟件對(duì)這些基因在福建柏不同組織（根、皮和鱗葉）混合樣品中的qPCR 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析。3 個(gè)軟件對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)為Ct值，理想的內(nèi)參基因平均Ct值通常在15～30之間[13]。通過比較8 個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值，發(fā)現(xiàn)除UBQ以外，其它7 個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值均在該范圍之內(nèi)，同時(shí)在軟件分析中UBQ穩(wěn)定性也較差。

圖5 候選內(nèi)參基因作為試驗(yàn)內(nèi)參基因分析目的基因的表達(dá)Fig.5 The candidate reference genes as test reference gene in the analysis of target gene expression

geNorm 和Normfinder 軟件均是根據(jù)M 值來評(píng)價(jià)分析，2 個(gè)軟件分析結(jié)果中最穩(wěn)定的均為ACT7，BestKeeper 則顯示UBC2b最穩(wěn)定，說明不同軟件分析得到的最穩(wěn)定內(nèi)參基因有一定差異。Fan 等研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論，其分析毛竹不同組織部位的穩(wěn)定內(nèi)參基因，在3 個(gè)軟件中候選內(nèi)參基因的排名均有所不同[25]。在5 個(gè)質(zhì)量濃度（0.32、1.6、8、40 和200 ng·μL?1）的不同組織cDNA 混合樣品中，geNorm 和BestKeeper 結(jié)果顯示5 個(gè)質(zhì)量濃度中最穩(wěn)定的均為ACT7，Normfinder 結(jié)果顯示5 個(gè)質(zhì)量濃度中最穩(wěn)定基因各有差異，推測(cè)可能是cDNA 混合樣品中不同組織存在一定表達(dá)差異造成的，但綜合其他2 個(gè)軟件分析結(jié)果，3 個(gè)軟件的總體結(jié)果仍趨于穩(wěn)定的內(nèi)參基因不會(huì)受到cDNA 質(zhì)量濃度變化的影響，ACT7為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。但單個(gè)內(nèi)參基因往往會(huì)產(chǎn)生一些試驗(yàn)誤差，2 個(gè)及以上內(nèi)參基因的組合可以減少誤差，提高準(zhǔn)確性[26]。如Xiao 等以不同時(shí)期杜鵑花的不同組織為材料，分析單個(gè)內(nèi)參基因和2 個(gè)內(nèi)參基因組合對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示2 個(gè)內(nèi)參基因組合比單個(gè)內(nèi)參基因的結(jié)果差異較小[27]。因此，geNorm軟件分析中標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析（Vn/Vn+1）有一定價(jià)值，其對(duì)候選內(nèi)參基因最佳配對(duì)數(shù)目的衡量，判斷內(nèi)參基因能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定歸一化的數(shù)量。geNorm 結(jié)果顯示V2/V3值小于0.15，說明2 個(gè)內(nèi)參基因的組合就能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定歸一化，即選擇穩(wěn)定性最好的ACT7和UBC2b組合。

利用軟件分析并不能保證一個(gè)內(nèi)參基因有準(zhǔn)確的結(jié)果，還需在利用相關(guān)目的基因在特定試驗(yàn)條件下驗(yàn)證篩選出的內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，才能得出真實(shí)可靠的定量數(shù)據(jù)[28]。因此，本研究選擇4 個(gè)FhTPS基因作為目的基因，以ACT7和UBC2b組合作為內(nèi)參基因，穩(wěn)定性最差的RH8基因作為對(duì)照，分析了目的基因在福建柏根、皮和鱗葉中的表達(dá)。定量分析結(jié)果驗(yàn)證了篩選出的ACT7和UBC2b能夠使目的基因有較為穩(wěn)定的相對(duì)表達(dá)水平且表達(dá)趨勢(shì)一致，RH8穩(wěn)定性差不適合作為內(nèi)參基因，該結(jié)果與geNorm 和BestKeeper 軟件分析結(jié)果一致，與Normfinder 軟件的結(jié)果有一定差異，但與3 個(gè)軟件的綜合分析結(jié)果一致。因此，通過對(duì)目的基因的定量分析對(duì)篩選出的內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證能夠?qū)浖治龅慕Y(jié)果進(jìn)行佐證，使內(nèi)參基因篩選結(jié)果更具科學(xué)性。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)比分析ACT7、UBQ、EF2、CACs、TIP41、UBC2b、RH8、GAPDH共 8 個(gè)候選內(nèi)參基因在福建柏不同質(zhì)量濃度的各組織cDNA 混合樣品中RT-qPCR 分析中的表達(dá)穩(wěn)定性，利用3 個(gè)分析軟件綜合分析并篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因ACT7與UBC2b，且ACT7和UBC2b組合能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定均一化，使定量結(jié)果更可靠；RH8表達(dá)不穩(wěn)定，不適合作為內(nèi)參基因。經(jīng)過4 個(gè)FhTPS目的基因的驗(yàn)證，確定了2 個(gè)基因的穩(wěn)定性。這對(duì)今后福建柏的基因定量表達(dá)研究有重要意義。