徐曉宇，張校亮，譚 慷，李曉春

(太原理工大學 a.物理與光電工程學院，新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點實驗室，b.生物醫(yī)學工程學院，太原 030024)

消費類電子產品如數(shù)碼相機、智能手機、掃描儀、光盤光驅等，滿足了人們日常生活的多方面需求。從科研人員的角度看，這些消費類電子產品具有強大的光電傳感、圖像采集、數(shù)據(jù)處理等能力，可以應用到醫(yī)療診斷領域，從而彌補傳統(tǒng)檢測儀器和檢測方法的時間長、成本高、操作復雜等缺點[1]。其中，光盤具有良好的光學特性和納米級的表面粗糙度，是進行生化反應的良好基底材料；光驅具有精密的光學讀取機制和伺服控制系統(tǒng)，能夠作為生物信號讀取裝置，國內外許多研究人員相繼開展基于光盤/光驅的生化分析研究[2]。2000年美國KIDO et al[3]首次提出標準光驅讀取生物光盤實現(xiàn)檢測的概念。西班牙MORAIS et al[4]通過將標準CD光盤改造為半透射半反射特殊光盤，并在光驅內安裝提取透射光強信號的光電二極管接收器和光敏觸發(fā)器，經軟件數(shù)據(jù)處理后實現(xiàn)定量檢測。區(qū)別于硬件改造的方式，本課題組深入研究光盤數(shù)據(jù)編碼、保護與糾錯機制，提出了一種軟件解決的數(shù)字化生物分子檢測方法[5]?；驹硎枪獗P表面的生物陣列會干擾光驅激光讀取刻錄數(shù)據(jù)，反映到光盤質量診斷軟件上就是產生數(shù)據(jù)校驗錯誤，且產生錯誤的情況與分析物濃度相關。利用該原理，在CD、DVD上實現(xiàn)了孕酮HCG、重金屬離子等物質的定量檢測[6-7]。相比于CD、DVD，藍光光驅采用更短波長的405 nm激光，使得激光聚焦光斑更小[8]。同時藍光光盤采用了更加高效的糾錯編碼格式，因而具有高效的突發(fā)錯誤糾正能力，在進行生物分子檢測時表現(xiàn)出更高的檢測靈敏度和分辨率[9]。利用該技術，成功建立了基于藍光技術的數(shù)字化分子檢測平臺[10]，實現(xiàn)了黃曲霉毒素B1的定量檢測和多種心肌梗死標志物的聯(lián)合診斷[11-12]。

利用數(shù)據(jù)糾錯原理的標準光驅檢測方法無需對硬件改造，可作為現(xiàn)場快速檢測的低成本、高靈敏度檢測工具。然而目前該方法依賴Windows平臺的非開源商業(yè)光盤質量診斷軟件，導致無法脫離電腦，無法實現(xiàn)系統(tǒng)集成；數(shù)據(jù)分析需借助多個數(shù)據(jù)處理軟件手動完成，過程較為繁瑣，依賴電腦且無法實現(xiàn)自動化分析。因而該方法用于現(xiàn)場快速檢測時存在一定的局限性。而嵌入式系統(tǒng)對用戶來說，是以應用為中心，軟硬件可裁剪，對硬件的體積、成本、功耗等有嚴格要求的專用計算機系統(tǒng)[13]。因此可利用嵌入式技術開發(fā)專用性的檢測儀器，通過軟硬件裁剪，實現(xiàn)更加便攜的應用。

基于此，本文提出了基于藍光光盤/光驅技術的生物分子嵌入式檢測系統(tǒng)與儀器的研發(fā)。通過構建以ARM開發(fā)板和藍光光驅為核心的硬件平臺，縮小了裝置的體積；將開源光盤質量診斷軟件和開發(fā)的數(shù)據(jù)處理程序整合為完整的檢測系統(tǒng)應用程序，實現(xiàn)了光盤上生物樣本的自動化分析；通過墨點陣列和鏈霉親和素實驗驗證了本系統(tǒng)的可行性和準確性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

磷酸氫二鈉(質量分數(shù)≥99.5%)、磷酸二氫鈉(質量分數(shù)≥99.0%)、氯化鈉(質量分數(shù)≥99.5%)、氫氧化鈉(NaOH，質量分數(shù)97.0%)、明膠(Gelatin，微生物學級)、無水檸檬酸(質量分數(shù)≥99.5%)、牛血清白蛋白(BSA)購買于美國Aladdin公司；2-嗎啉乙磺酸(MES，質量分數(shù)≥99.0%)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，質量分數(shù)≥97.0%)、1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，質量分數(shù)≥98.0%)、Tween-20購買于美國 Sigma-Aldrich公司；對苯二酚(質量分數(shù)≥99.0%)、硝酸銀(質量分數(shù)≥99.8%)購買于天津科密歐化學試劑有限公司；氨基修飾的生物素(Amine-PEG2-biotin)購買于美國Thermo Scientific公司；納米金-鏈霉親和素結合物(Nanogold-streptavidin conjugate)購買于美國Nanoprobes公司。

紫外臭氧清洗機(PSD-UV，美國 Novascan公司)，噴墨打印機(Epson L810，日本Epson公司)，ARM開發(fā)板(JZ2440，深圳百問網科技有限公司)，標準藍光光盤(25GB BD-R，日本Verbatim公司)，藍光光驅(PX-B950SA，日本Plextor公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1嵌入式生物分子檢測系統(tǒng)設計

嵌入式生物分子檢測系統(tǒng)包含硬件系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)，如圖1(a)所示。硬件部分包括ARM開發(fā)板(集成顯示屏、觸摸屏等常用外設)、外置光驅轉接板、藍光光驅，藍光光驅通過USB接口與ARM開發(fā)板通信。軟件部分包括嵌入式底層軟件和圖形化應用程序，開發(fā)平臺為PC Linux，經交叉編譯后運行于ARM開發(fā)板硬件。通過開發(fā)和移植U-Boot引導加載程序、Linux內核、根文件系統(tǒng)以及藍光光驅等硬件驅動程序，完成嵌入式系統(tǒng)底層軟件開發(fā)，為應用程序提供運行環(huán)境。圖形化應用程序實現(xiàn)用戶功能，即控制藍光光驅進行生物分子濃度定量檢測。圖形化應用程序包括藍光光盤質量診斷模塊、數(shù)據(jù)處理模塊、曲線擬合模塊以及應用程序GUI(圖形用戶界面)。藍光光盤質量診斷模塊實現(xiàn)光驅控制、糾錯掃描并輸出糾錯數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)處理模塊實現(xiàn)對糾錯數(shù)據(jù)的處理，對特征信號定位并進行積分運算；曲線擬合模塊輸出定量檢測結果并顯示擬合曲線；應用程序GUI是上述三個功能模塊的可視化操作界面。使用C語言開發(fā)命令行程序，使用QT開發(fā)應用程序GUI，最終將各個模塊整合為完整的嵌入式平臺應用軟件。開發(fā)的嵌入式分子檢測系統(tǒng)裝置實物圖如圖1(b)所示(光驅尺寸170 mm×146 mm×42 mm，開發(fā)板尺寸105 mm×88 mm×40 mm).

圖1 嵌入式分子檢測系統(tǒng)設計與實現(xiàn)

基于藍光技術的生物分子檢測方法采用光盤質量診斷軟件PlexUtilities進行糾錯掃描，該軟件為Windows平臺非開源商業(yè)軟件，無法移植運行于嵌入式Linux平臺，因此本系統(tǒng)的藍光光盤數(shù)據(jù)糾錯模塊首先借助開源光盤質量診斷軟件QPxTool-0.7.2的代碼來實現(xiàn)。移植并修改QPxTool開源代碼，使之運行于嵌入式系統(tǒng)中，并輸出光盤糾錯數(shù)據(jù)結果。

藍光光盤數(shù)據(jù)糾錯是以糾錯塊為單位進行的，一個糾錯塊大小為64 kB，光盤質量診斷軟件輸出長距碼(LDC)和突發(fā)指示子碼(BIS)兩種規(guī)范的測試參數(shù)[14]。25 GB BD-R的用戶數(shù)據(jù)存儲容量為23.31 GB，則糾錯塊個數(shù)為383 911(23.31 GB/64 kB)個，即LDC和BIS參數(shù)個數(shù)均為383 911.圖2(a)為光盤糾錯軟件輸出的BIS分布圖，橫軸為藍光光盤的邏輯位置(GB)，縱軸為BIS校驗碼數(shù)。其中，5個信號特征峰是生物陣列產生的錯誤數(shù)集合。從信號的局部放大圖可以看出一個信號特征峰是由多個離散數(shù)據(jù)峰構成，每個離散峰的寬度為64 kB(圖2(a)右圖所示)。由于光盤背景引起的數(shù)據(jù)錯誤遠小于生物陣列引起的錯誤，對于檢測信號來說可忽略。為實現(xiàn)自動化檢測分析，需數(shù)據(jù)處理程序自動識別特征峰峰位并對特征信號中的離散數(shù)據(jù)進行積分。識別過程如圖2(b)所示，原始數(shù)據(jù)經過數(shù)據(jù)量均值縮減、多次包絡運算、自動閾值計算和閾值分割后，計算出每個信號特征峰的起始和結束位置，從而實現(xiàn)信號識別、定位、分割。

1.2.2墨點陣列的制備與讀取

使用Blu-ray Disc Suite刻錄軟件(訊連科技有限公司)將約23.31 GB數(shù)據(jù)刻錄到空白藍光光盤上，使之沒有空閑容量。將光盤進行紫外臭氧處理15 min后，使用噴墨打印機的配套設計軟件Print CD設計打印圖案并控制噴墨打印機在藍光光盤上打印墨點陣列。然后將打印后的光盤放入烘干箱干燥。本文設計了尺寸不同、灰度一致的墨點陣列和尺寸一致、灰度不同的墨點陣列。使用移植到嵌入式系統(tǒng)的光盤質量診斷軟件QPxTool的Error Correcttion功能對光盤進行糾錯掃描，掃描速度為4倍速。

1.2.3生物素-鏈霉親和素反應陣列的制備與讀取

刻錄數(shù)據(jù)后，將光盤浸泡在濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液中并放置于(55±1)℃干燥箱中進行內酯水解反應，水解1.5 h后徹底沖洗光盤表面并用氮氣吹干。然后在光盤反應區(qū)鋪設活化液(將100 mmol/L EDC+25 mmol/L NHS加入到pH值為5.8的MES溶液中混合而成)，4 h后沖洗干凈并將PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流體通道模板貼在活化區(qū)域。向微通道注入biotin溶液(1 mg/mL)，固定8 h后注入buffer1(將150 mmol/L NaCl+4% BSA加入到pH值為7.4的PBS中混合而成)，封閉3 h后注入buffer2(150 mol/L NaCl+0.8% BSA+0.1% Gelation+0.05% Tween-20，百分數(shù)為質量分數(shù))，封閉1 h.將不同濃度的納米金-鏈霉親和素結合物溶液依次注入不同通道，反應1 h后揭掉PDMS模板，使用buffer1封閉1 h.沖洗過后使用銀染液(48 mmol/L硝酸銀+182 mmol/L對苯二酚)對反應區(qū)域銀染5 min，徹底沖洗光盤并用氮氣吹干后，將光盤放入開發(fā)的嵌入式生物分子檢測儀器中，操作軟件系統(tǒng)進行光盤上鏈霉親和素濃度的定量檢測分析。

圖2 特征信號自動化處理過程

2 結果與討論

2.1 嵌入式平臺生物分子檢測可行性分析

光盤質量診斷軟件輸出LDC和BIS兩種規(guī)范的光盤糾錯數(shù)據(jù)，LDC模式下檢測信號具有更高的信噪比，但當分析物濃度較高時檢測信號容易達到飽和，因此一般選用BIS糾錯數(shù)據(jù)作為定量檢測的分析參數(shù)[15]。在ARM開發(fā)板上搭建完成嵌入式底層環(huán)境和QT圖形環(huán)境后，將修改后的QPxTool軟件交叉編譯并移植到目標板平臺運行。為驗證該軟件在嵌入式平臺下用于生物分子檢測的可行性，通過噴墨打印實驗進行測試，并與Windows平臺下PlexUtilities軟件的掃描結果進行對比。在藍光光盤表面打印了一組灰度相同(均為0)，直徑分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mm的圓形墨點陣列。如圖3(a)所示為PlexUtilities對墨點光盤的BIS糾錯結果，8個特征信號與墨點的物理位置一一對應。圖3(b)為嵌入式平臺下QPxTool的BIS糾錯結果，橫坐標為藍光光盤的邏輯位置(GB)，縱坐標為BIS校驗碼數(shù)。糾錯結果中出現(xiàn)了8個與PlexUtilities結果中相同趨勢且明顯高于背景的特征信號：隨著墨點直徑增加，特征信號的幅值和寬度均增加。圖3(c)中建立BIS錯誤總數(shù)與墨點面積的關系曲線，兩者之間呈現(xiàn)出良好的線性關系，線性擬合方程為y=3 208.272 6x+48.807 1，線性擬合系數(shù)R2=0.993 7.由實驗結果可知，QPxTool的光盤質量診斷功能在嵌入式Linux平臺下可以用于光盤上生物分子的檢測，且可以明顯檢測到直徑為0.1 mm的墨點，表明了本檢測系統(tǒng)的橫向分辨率在100 μm以下。

圖3 不同尺寸墨點陣列糾錯掃描結果分析

為進一步驗證該軟件在嵌入式平臺下用于生物分子檢測的可行性，對尺寸相同灰度不同的墨點陣列進行了檢測分析。打印了灰度值分別為240，210，180，150，120，90，60，30，0，直徑均為1 mm的圓形墨點陣列。圖4(a)為該墨點陣列光盤在PlexUtilities軟件中的糾錯掃描結果，墨點顏色隨著灰度值減小而逐漸加深，且墨點位置在物理位置上與掃描結果中的信號特征峰完全對應。圖4(b)為該墨點陣列光盤在嵌入式平臺下使用QPxTool軟件的糾錯掃描結果，信號趨勢和峰值與圖4(a)基本一致：當灰度值大于180時，因墨點干擾而產生的BIS錯誤太小而被淹沒于背景噪聲，無明顯信號產生。當灰度值小于180時，隨著墨點顏色加深，產生的信號幅值增加，寬度基本不變。BIS密度與墨點灰度關系如圖4(c)，在180～90的灰度范圍內，BIS錯誤密度近似線性增長，在90～0的灰度范圍內，BIS錯誤密度增長趨于平緩。這是由于灰度值較小的墨點吸收了大部分激光，使BIS變化減慢。

圖4 不同灰度墨點陣列糾錯掃描結果

2.2 嵌入式檢測系統(tǒng)的準確性分析—藍光光盤表面生物素-鏈霉親和素反應的定量檢測

生物素-鏈霉親和素之間具有高強度的非共價結合作用，常作為生物反應放大系統(tǒng)被用于生化檢測分析中，本文通過該實驗驗證所開發(fā)嵌入式檢測系統(tǒng)的準確性。基于藍光技術的鏈霉親和素檢測實驗中，當鏈霉親和素質量濃度低于0.5 μg/mL時，BIS密度近似線性增長，當質量濃度達到0.6 μg/mL時檢測信號達到飽和[15]。因此，本實驗借助PDMS微通道在藍光光盤上制備了三組鏈霉親和素的生物反應條帶，分別為6個標準樣品(0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5 μg/mL)、2個待測樣品(0.03，0.3 μg/mL，重復3次)。

將制備好的生物陣列光盤放入檢測系統(tǒng)的藍光光驅中，控制檢測系統(tǒng)的光盤質量診斷功能模塊進行糾錯掃描。掃描完成后的光盤BIS錯誤分布圖如圖5(a)所示，出現(xiàn)了12個與鏈霉親和素樣品反應條帶對應的BIS特征峰。隨著鏈霉親和素濃度的增加，銀染條帶還原聚集的銀顆粒數(shù)目逐漸增多，對光驅激光擾動越強，從而產生的BIS校驗錯誤越多。如圖5(b)所示，使用數(shù)據(jù)處理模塊對光盤BIS糾錯數(shù)據(jù)進行處理，點擊“Start”鍵，系統(tǒng)識別并顯示出與12個樣品對應的BIS特征峰信號。在對應的條帶面積輸入框和標準濃度輸入框中輸入與樣品對應的參數(shù)后，計算出6個標準樣品BIS密度分別為180，357，768，1 768，2 999，3 241，兩組待測樣品對應的BIS密度分別為320，384，429和2 057，2 158，2 345.如圖5(c)所示，切換到曲線擬合模塊界面，根據(jù)標準樣品濃度和與其對應的BIS密度生成標準曲線，繼而計算出兩組待測樣品質量濃度均值分別為(0.033±0.007)μg/mL和(0.305±0.018)μg/mL.檢測結果與待測樣品的實際質量濃度0.03，0.3 μg/mL基本一致，說明所開發(fā)的嵌入式檢測系統(tǒng)在實現(xiàn)便攜性、自動化檢測的同時保證了可靠的準確性。

圖5 鏈霉親和素檢測分析

3 結論

本文提出了結合嵌入式技術的生物分子檢測系統(tǒng)開發(fā)與定量檢測方案，使用嵌入式Linux開發(fā)技術，完成了基于藍光光盤/光驅技術的生物分子嵌入式檢測系統(tǒng)與儀器的設計與開發(fā)，使標準光盤光驅成為專用性的生物分子檢測設備，極大的方便用戶使用。墨點實驗表明本系統(tǒng)能夠檢測到光盤表面100 μm以下的陣列。通過生物素-鏈霉親和素實驗介紹了該檢測系統(tǒng)的自動化檢測分析流程并驗證了檢測結果的準確性，且所開發(fā)的儀器便攜性好、操作簡單，可作為醫(yī)療診斷、食品安全等應用場景下的即時檢測分析工具。