林一禾 朱淑嬪 陳游沓

浙江省溫州市中西醫(yī)結合醫(yī)院(325000)

人乳頭瘤病毒(HPV)易感染女性宮頸黏膜復層鱗狀上皮。多數(shù)生育期女性會出現(xiàn)一過性宮頸HPV感染，HPV持續(xù)感染是宮頸癌及癌前病變發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素[1]，研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)生是多種因素相互作用結果[2]。調節(jié)性T淋巴細胞(Treg)是一群發(fā)揮免疫抑制功能的獨特輔助性T淋巴細胞亞群，可以調控腫瘤免疫應答的整個階段[3]。本研究分析HR-HPV持續(xù)感染患者宮頸Treg的表達，探討Treg與宮頸高級病變相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2018年5月—2020年10月本院婦科收治的高危型HPV陽性但無需特殊治療者476例為研究對象。納入標準：①年齡18～50歲；②行陰道鏡下宮頸組織活檢，病理學診斷≤低度鱗狀上皮內瘤變(LSIL)。排除標準：①妊娠期或哺乳期；②1個月內應用陰道灌洗或陰道用藥治療；③既往進行過宮頸相關治療；④患有免疫系統(tǒng)疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等；⑤除宮頸癌以外其他器官惡性腫瘤。參照《中國宮頸癌篩查及異常管理相關問題專家共識》中的診治流程[4]，宮頸活檢組織病理學診斷≤LSIL的患者無需治療但在12個月時需再次行HPV-DNA檢測。根據(jù)隨訪結果將研究對象分為HPV持續(xù)感染組(178例)與HPV轉陰組(298例)。本研究經本院倫理委員會審批。參與對象均簽署知情同意書。

1.2 宮頸局部調節(jié)性T淋巴細胞檢查

一次性陰道窺器充分暴露宮頸，專用刷頭于宮頸管順時針或逆時針旋轉3～5圈，將刷頭置于液基細胞學保存液中，常規(guī)處理后應用流式細胞儀檢測單細胞懸液中Treg。將細胞濃度調整至(1～2)×107個/ml，取100μl，加入鼠抗人單克隆抗體，室溫避光20min，加冷固定破膜劑，4℃避光孵育30 min，細胞染色，進行流式細胞儀檢測，檢測CD4+CD25+Foxp3+細胞占CD4+細胞比為Treg百分比。

1.3 HPV-DNA檢測

使用一次性陰道窺器充分暴露宮頸，以HPV專用細胞刷于宮頸鱗柱狀交界處取材(取材需停留10s)，取材后的細胞刷置于保存液中。HR-HPV由本院檢驗科醫(yī)師進行檢測，采用雜交捕獲2代(HC-Ⅱ)方法，檢測13種高危型HPV(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Treg表達情況

HPV持續(xù)感染組年齡(32.7±10.1歲)與HPV轉陰組(33.5±12.9歲)無差異(P>0.05)，Treg(8.2±2.0)%高于HPV轉陰組(6.1±3.8)%(t=8.057，P<0.001)。

2.2 HPV持續(xù)感染組臨床指標與Treg

在HPV持續(xù)感染組178例中，年齡≥35歲、多重HPV感染、宮頸活檢為LSIL患者Treg值高于年齡<35歲、單一HPV感染、宮頸活檢為慢性炎癥患者(P<0.05)，體質指數(shù)(BMI)≥24kg/m2與<24kg/m2者Treg值未見差異(P>0.05)。見表1。

表1 HPV持續(xù)感染組臨床指標與Treg比較

2.3 HPV持續(xù)感染的高危因素

以HPV持續(xù)感染為因變量，以年齡、BMI、HPV感染類型、Treg(以所有研究對象的均值為截斷值進行賦值)為自變量行l(wèi)ogstic回歸分析。結果顯示，年齡≥35歲、多重HPV感染、Treg≥7.8%為HPV持續(xù)感染的獨立高危因素(P<0.05)(表2)。

表2 HPV持續(xù)感染的高危因素分析

2.4 Treg對HPV持續(xù)感染的預測價值

ROC曲線分析結果顯示，Treg對HPV持續(xù)感染具有預測效能(P<0.001)，AUC為0.834(95%CI：0.754～0.914)，特異性為69.1%，靈敏度為73.4%，最佳截斷值為8.4%。

3 討論

HPV是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，黏膜型HPV感染是宮頸癌的高危因素。70%～90%免疫正常的女性在感染HPV后12～30個月后可自行清除，僅有小部分患者持續(xù)感染而引發(fā)宮頸病變[5]。有研究發(fā)現(xiàn)宿主的免疫狀態(tài)和HPV感染引起的免疫逃逸是持續(xù)性HPV感染導致宮頸細胞癌變的主要原因[6]。

機體免疫環(huán)境復雜多樣，HPV、免疫細胞與局部微環(huán)境間均存在相互制約、相互調節(jié)作用和影響[7]。T淋巴細胞是細胞免疫的主要效應細胞，Treg細胞是T細胞中的一種類型，是CD4+CD25+FOXP3+的T細胞，通過多種機制抑制機體的免疫功能，還可抑制機體對腫瘤的免疫應答，導致腫瘤免疫耐受[8]。有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)多種感染性或自身免疫性疾病均與Treg細胞引起的免疫逃逸有關。

HPV感染可以導致T細胞活化增殖，Treg細胞的上調抑制機體的免疫應答，使HPV病毒躲過了免疫防護，導致持續(xù)感染[11]。有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者外周血Treg細胞異常升高，且表達量與宮頸癌分期和腫瘤大小有關[12]。目前，多數(shù)研究僅分析血液中Treg細胞的異常改變，然而在疾病早期，病變局部免疫抑制出現(xiàn)在機體全身免疫功能改變之前。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，與HPV病毒載量相比，宮頸局部Treg細胞與宮頸病變的關系更加密切。

本研究發(fā)現(xiàn)HPV持續(xù)感染者的宮頸Treg細胞表達高于一過性感染者，且持續(xù)感染者的Treg細胞表達水平較集中，說明HPV持續(xù)感染者宮頸局部免疫抑制明顯。比較發(fā)現(xiàn)，在HPV持續(xù)感染者中年齡≥35歲、多重HPV感染、宮頸活檢為LSIL患者Treg高于年齡<35歲、單一HPV感染、宮頸活檢為慢性炎癥患者，推測年齡、HPV感染種類及宮頸病變與Treg細胞存在相互交叉關系。矯正了年齡、BMI、HPV感染類型后發(fā)現(xiàn)，宮頸Treg細胞比例升高是HPV持續(xù)感染的獨立危險因素，相對于Treg細胞比例<7.8%者來說，≥7.8%者HPV持續(xù)感染風險增加2.306倍。此外，宮頸Treg細胞比例對HPV持續(xù)感染還具有預測效能，AUC為0.834，預測效能良好，當宮頸Treg細胞>8.4%時預測HPV持續(xù)感染的靈敏度為73.4%，特異性為69.1%。

Treg細胞負向調節(jié)免疫反應的特性可能導致HPV持續(xù)感染，而這種持續(xù)感染無疑增加了宮頸癌前病變或宮頸癌的風險。在臨床工作中，針對HPV感染的患者應密切關注宮頸局部免疫抑制的微環(huán)境，對HPV的轉歸給予初步預判，有利于個性化治療隨訪方案的制定，也有助于HPV陽性患者的管理。