沈 漣 華沛旻* 李海波

1.江蘇省無錫市婦幼保健院(214000)；2.江蘇省南通市婦幼保健院

21三體綜合征是常見染色體非整倍出生缺陷類疾病，給家庭造成經濟和精神壓力，也給社會帶來一定負擔[1-2]。產前篩查診斷并采取措施及時終止妊娠，是目前降低其發(fā)生的唯一方法。羊水細胞染色體核檢驗為當前臨床診斷21三體綜合征的金標準，然而羊水穿刺難以被孕婦普遍接受[3-4]。母體血清學檢測是21三體綜合征產前篩查重要方法之一，但檢出率僅66.7%[5]。近年有研究發(fā)現母體外周血漿中有游離胎兒mRNA，對染色體異常胎兒的檢出有一定價值[6]。本研究回顧性分析產前篩查孕婦臨床資料，探討母體血清學及血中胎兒游離mRNA檢測在21三體綜合征產前篩查價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2016年4月—2017年10月于本院產前篩查并確診胎兒為21三體綜合征的單胎孕婦30例(綜合征組)和胎兒正常的單胎孕婦60例(健康組)臨床資料，年齡25～41歲，孕周15～20+6周。孕婦產前均行母體血清學、母體血胎兒游離mRNA和外周血胎兒游離DNA無創(chuàng)(NIPT)檢測。本研究經本院倫理委員會審批。孕婦均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1母體血清學抽取孕婦外周靜脈血離心分離血清，-20℃保存。采用熒光免疫分析檢測其血清甲胎蛋白(AFP)、絨毛膜促性腺激素(HCG)、游離雌三醇(uE3)水平，結合孕婦年齡、孕周、體重指標采用T1-risk風險統(tǒng)計軟件計算21三體綜合征發(fā)生風險，以1:270作為高風險切割值。

1.2.2母體血游離胎兒mRNA①標本處理：抽取孕婦外周靜脈血抗凝4℃離心取血清-20℃保存；血漿標本4℃離心取上清液至滅菌Eppendorf管中，-80℃保存。②人血漿總RNA抽?。好?.6ml血漿中加入TRIZOL試劑2ml，震蕩混勻，室溫下靜置5min后加入氯仿400μl，混勻，4℃離心15min，靜置取上清液，加入等體積異丙醇及冰乙酸200μl，-20℃靜置30min，4℃離心20min，除去上清液，70%乙醇重懸，4℃離心5min，除去殘液，37℃晾干，加入35μl雙蒸水溶解沉淀，-80℃保存。③總RNA反轉錄：反應體系總體積為20μl，見表1，反應條件為30°C 60min，42°C 5min，99℃ 5min，所獲產物-20℃保存。④參照相關文獻設計合成引物，見表2。⑤QF-PCR：反應體系總體積為20μl，見表3，反應條件為95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火15s，72℃延伸45s，共40個循環(huán)。

表1 總RNA反轉錄體系

表2 引物序列

表3 QF-PCR反應體系

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩組孕婦血清學指標比較

綜合征組血清AFP Mom、uE3 Mom低于健康組，HCG Mom高于健康組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組孕婦血清學指標比較

2.2 兩組孕婦基因檢出率比較

兩組孕婦外周血均檢測出HPL、β-hCG、TFPI2、PLAC4基因，兩組基因檢出率(100.0%、100.0%)無差異(P>0.05)。

2.3 兩組孕婦血漿基因mRNA表達量比較

孕婦血漿中，綜合征組HPL、β-hCG、PLAC4基因mRNA表達量均大于健康組(P<0.05)，TFPI2基因mRNA表達量與健康組無差異(P>0.05)。見表5。

表5 兩組孕婦血漿基因mRNA表達量比較

2.4 孕婦血清學、孕婦血胎兒游離mRNA和NIPT篩查21三體綜合征效能

孕婦血胎兒游離mRNA檢測與NIPT篩查21三體綜合征的AUC值無差異(Z=0.888，P>0.05)但均大于血清學檢測(Z=2.964、3.287，均P<0.05)。見表6。

表6 不同方法篩查21三體綜合征 效能

3 討論

21三體綜合征是染色體異常導致的一種先天性病變，發(fā)生率達出生人口的1/600[7-8]。產前篩查、診斷21三體綜合征為優(yōu)生關注內容。由于羊水穿刺有創(chuàng)操作，可能會影響孕婦及胎兒健康，不適用于廣泛篩查；而通過產前篩查確定高危人群，再采用羊水細胞染色體核檢驗明確診斷，是當前21三體綜合征產前診斷的主要方法。

母體血清學檢測是目前臨床對孕婦產前篩查的一種檢測方法，檢測指標包括AFP、HCG、uE3等，因單項指標檢測效能不高需行多個指標聯(lián)合檢測[9]。本院孕婦孕中期主要行血清AFP、HCG、uE3三聯(lián)檢查。本次結果顯示，21三體綜合征組血清AFP Mom、uE3 Mom值均低于健康組，HCG Mom值高于健康組，提示孕婦血清AFP、Free-β-hCG、uE3水平與21三體綜合征有一定關系。盡管母體血清學檢測在21三體綜合征產前篩查中應用較廣，當假陽性率為5%～9%時檢出率為85%～90%，但仍缺乏診斷力，同時也存在敏感度低、假陽性率較高等問題[10]。本研究母體血清學篩查21三體綜合征的敏感度和特異度分別為66.7%和80.0%，可見母體血清學檢測檢出21三體綜合征的效能并不高。

探尋新的無創(chuàng)產前染色體疾病篩查方法是眾多醫(yī)學者研究重點，孕婦外周血胎兒游離DNA的發(fā)現在無創(chuàng)產前染色體疾病篩查中具有重要意義。眾多研究分析了母血游離胎兒DNA在染色體疾病中的診斷價值，而RNA作為遺傳信息載體，在臨床產前篩查染色體病變中的研究相對較少。過去認為人體血液中含有RNA酶，因此機體血漿和血清中不存在游離RNA；但是隨著大量研究發(fā)現，孕婦血漿和血清中存在胎兒游離RNA，且穩(wěn)定性較好[11-12]。有研究對子癇前期孕婦和正常孕婦血漿檢測發(fā)現，前者血漿游離mRNA含量顯著高于后者，認為孕婦血漿游離mRNA水平可以評估和監(jiān)測部分病理妊娠[13]。PLAC4基因來源于21號染色體，本次研究分析顯示兩組孕婦外周血均檢測出HPL、β-hCG、TFPI2和PLAC4基因，且HPL、β-hCG、PLAC4基因mRNA表達量21三體綜合征組均大于健康組，與程蔚蔚等[14]研究結果相符，提示此基因有望成為21三體綜合征胎兒產前篩查的重要標志物。本研究檢測篩查效能顯示，母體血胎兒游離mRNA檢測篩查21三體綜合征的AUC值大于母體血清學檢測，敏感度和特異度80.0%以上，但與NIPT AUC值無差異，提示母體血胎兒游離mRNA檢測對21三體綜合征的診斷效能較高且與NIPT接近。

綜上所述，母體血清學檢測和血胎兒游離mRNA檢測在21三體綜合征產前篩查中均有重要價值且后者效能更高。但由于胎兒游離mRNA檢測更復雜、費用相對較高，在臨床中目前尚未推廣使用，期待隨著檢測技術的提高可能成為一項產前篩查的常用方法。