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        DAPK-1與p62/SQSTM1在早發(fā)型重度子癇前期患者胎盤組織中表達(dá)及臨床意義

        2021-03-18 02:33:08周嬌嬌薛秀珍
        關(guān)鍵詞:發(fā)型胎盤螺旋

        周嬌嬌 薛秀珍

        河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院(洛陽,471003)

        子癇前期(PE)屬于一種妊娠期高血壓疾病,臨床主要表現(xiàn)為妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿及全身器官功能損害,可引起胎兒宮內(nèi)缺氧和生長(zhǎng)受限,是導(dǎo)致孕婦和胎兒死亡的主要原因,世界范圍內(nèi)發(fā)病率為3%~5%[1-2]。根據(jù)癥狀出現(xiàn)時(shí)孕周,以孕周34周為界限分為早發(fā)型PE、晚發(fā)型PE。PE是一種妊娠特異性疾病,發(fā)病機(jī)制及病因均不清楚,目前研究認(rèn)為,炎癥和氧化應(yīng)激是胎盤自噬改變的潛在刺激因素,會(huì)引起胎盤功能障礙和妊娠病理。DAPK-1和P62/SQSTM1均屬于自噬調(diào)節(jié)因子,其在PE以自噬的形式發(fā)揮著特殊的影響,對(duì)生殖功能具有重要的調(diào)控作用。DAPK-1屬于細(xì)胞死亡和自噬的調(diào)節(jié)因子[3],是胎盤組織中廣泛存在的一種分子。在線生物全球定位系統(tǒng)(Bio GPS)顯示,DAPK-1在胎盤中的表達(dá)水平是其他任何人類細(xì)胞或組織的3.5倍。P62/SQSTM1是一種自噬降解的底物,在PE胎盤活檢樣本的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(EVTs)中積累,在體內(nèi)表現(xiàn)為自噬受損[4],因此自噬狀態(tài)在PE胎盤中出現(xiàn)改變,并且越來越多的研究表明自噬參與妊娠。本研究通過檢測(cè)PE胎盤組織中DAPK-1、P62/SQSTM1的表達(dá)情況及兩者相關(guān)性研究,探討早發(fā)型重度PE的病理生理機(jī)制。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        收集2014年12月—2015年10月本院病理科66例PE和30例正常孕婦胎盤組織石蠟標(biāo)本,其中早發(fā)重度PE 26例,晚發(fā)重度PE 40例,排除:①多胎妊娠、羊水異常、胎兒畸形、胎盤早剝、胎兒宮內(nèi)窘迫、發(fā)育遲緩患者;②先天性疾病、其他原發(fā)疾病及心血管疾病等合并癥及并發(fā)癥;③合并其他產(chǎn)科并發(fā)癥及其他內(nèi)科合并癥者;④孕期無急、慢性感染性疾病,無煙酒等不良嗜好。診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》第9版標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過本院倫理委員會(huì)審查,且所有參與者均知情同意并簽署知情同意書。

        1.2 方法

        1.2.1SABC法染色(試劑盒均為博士德產(chǎn)品)石蠟標(biāo)本4μm切片。兔抗人DAPK-1多克隆抗體、兔抗人p62/SQSTM1多克隆抗體。經(jīng)過脫蠟、水化、高壓熱修復(fù);3%的H2O2去離子水室溫孵育10min,PBS沖洗4次(5min/次);加入5%山羊血清,37℃孵育30min,甩干,直接滴加兔抗人DAPK-1多克隆抗體、兔抗人p62/SQSTM1多克隆抗體,4℃過夜;放置室溫用PBS沖洗4次(5min/次);滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG,37℃孵育30min,PBS沖洗4次(5min/次);滴加SABC,37℃孵育30min,PBS沖洗4次(5min/次);室溫下進(jìn)行顯微鏡下顯色劑著色10min,蒸餾水充分洗滌后以終止反應(yīng),再依次以通過蘇木素復(fù)染40s,分化液2s,藍(lán)化液2min,再蒸餾水沖洗3min后,通過梯度乙醇脫水和二甲苯的透明化,中性樹膠固定封片,最后在顯微鏡下觀察,出現(xiàn)棕黃(褐)色視為陽性染色。

        1.2.2結(jié)果判定任意選取5個(gè)高倍鏡視野,陽性細(xì)胞占比<25%,1分;≥25%~<50%,2分;≥50%~<75%,3分;≥75%,4分。染色強(qiáng)度:無著色,0分;淺黃色,2分;棕黃色,3分;棕褐色,4分。陽性細(xì)胞占比與染色強(qiáng)度之和進(jìn)行評(píng)估:0~1分,陰性(-);2~3分,弱陽性(+);4~5分,中度陽性(++);>5分,強(qiáng)陽性(+++)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 一般情況

        早發(fā)重度PE患者年齡(30.9±5.6)歲,孕周(37.5±1.6)周;<34孕周正常孕婦10例作為其對(duì)照組,年齡(27.6±4.0)歲,孕周(38.6±1.8)周;兩組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。晚發(fā)型發(fā)重度PE患者年齡(27.5±6.0)歲,孕周(37.5±1.6)周;>34孕周正常孕婦20例為對(duì)其照組,年齡(28.4±4.4)歲,孕周(38.6±1.8)周。兩組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

        2.2 DAPK-1、p62/SQSTM1的表達(dá)情況

        SABC法檢測(cè)顯示DAPK-1陽性顆粒為棕褐色,主要表達(dá)于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿;p62/SQSTM1陽性顆粒為棕褐色,表達(dá)在絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿。DAPK-1在早發(fā)型重度PE組的陽性表達(dá)較對(duì)照組和晚發(fā)型重度PE組均高(χ2=26.816,P<0.05;χ2=11.510,P<0.05);DAPK-1在晚發(fā)型重度PE組的陽性表達(dá)高于對(duì)照組(χ2=6.076,P<0.05)。p62/SQSTM1 在早發(fā)型重度PE組的陽性表達(dá)低于對(duì)照組和晚發(fā)型重度PE組(χ2=18.379,P<0.05;χ2=5.442,P<0.05);晚發(fā)型重度PE陽性表達(dá)低于對(duì)照組(χ2=6.076,P<0.05)。見圖1(2252頁)、表1。

        表1 各組胎盤組織中DAPK-1、p62/SQSTM1的陽性表達(dá)比較[例(%)]

        2.3 胎盤組織中DAPK-1與p62/SQSTM1相關(guān)性分析

        DAPK-1和p62/SQSTM1在PE胎盤組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.505,P<0.05)。

        3 討論

        PE是一種多因素、多機(jī)制及多通路致病的疾病,目前研究認(rèn)為,EVTs深入侵犯子宮螺旋動(dòng)脈,破壞肌層和彈力層,取代血管內(nèi)皮細(xì)胞,這使螺旋動(dòng)脈擴(kuò)張并且引起子宮胎盤血流量增加,因此,如果此階段過程失敗導(dǎo)致子宮胎盤血流減少,并且低氧應(yīng)激會(huì)影響胎盤異常形成[5]。關(guān)于早發(fā)EP的病因假說主要是基于EP滋養(yǎng)層浸潤(rùn)淺,胎盤發(fā)育不良。研究發(fā)現(xiàn),自噬與妊娠高血壓發(fā)病過程中的滋養(yǎng)細(xì)胞功能受損、母胎免疫反應(yīng)失衡、子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不良、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和氧化損傷等有密切關(guān)系[5-6]。

        研究發(fā)現(xiàn),DAPK-1是一種自噬分子,在暴露于炎癥刺激的妊娠早期胎盤外植體中顯著下調(diào)[7]。DAPK-1 是凋亡的正性調(diào)節(jié)因子,參與多種信號(hào)通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、自噬、細(xì)胞黏附和遷移。女性妊娠時(shí)存在胎盤組織滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過度 , 影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵入、子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不足,導(dǎo)致“胎盤淺著床”,使胎盤血液灌注量減少 , 導(dǎo)致 PE的發(fā)生。據(jù)已知相關(guān)類似蛋白的研究得知,DAPK-1可能主要表達(dá)在合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)中,而低氧胎盤組織中的表達(dá)水平高于常氧胎盤組織[8]。自噬過度激活時(shí),胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞釋放的部分物質(zhì)可誘導(dǎo)母體發(fā)生免疫反應(yīng),從而使其可釋放一些炎性介質(zhì)(如TNF-α)可與DAPK-1共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡、自噬和程序性壞死[9]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SABC法檢測(cè)DAPK-1在正常、早發(fā)型重度PE、晚發(fā)型重度PE胎盤中的表達(dá),結(jié)果顯示DAPK-1在3組胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞層中均表達(dá),但DAPK-1的表達(dá)隨著PE疾病的嚴(yán)重程度而增加,與既往研究結(jié)果,DAPK-1的mRNA蛋白表達(dá)在EP的妊娠胎盤中升高,提示致病因子的來源可能為胎盤相符合[10]。DAPK-1的表達(dá)增高限制滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)等致使胎盤淺著床等可能是引起早發(fā)型重度PE的原因。

        P62是一種在人類和動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白,是氨基酸感應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的信號(hào)中樞[11]。p62作為泛素化底物降解的選擇性自噬受體,是mTORC1通路的積極調(diào)節(jié)因子,屬于細(xì)胞自噬和mTORC1通路,是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),可控制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,加速對(duì)環(huán)境線索的反應(yīng)[12-13]。自噬是p62降解的原因,因此當(dāng)自噬異常損傷導(dǎo)致p62大量的積累,進(jìn)而形成p62陽性聚集結(jié)構(gòu)和泛素[14]。在早發(fā)型子癇患者胎盤中,與正常妊娠胎盤相比,高血壓患者胎盤中的自噬激活蛋白LC3-II增加,p62減少[15]。為探討了解引起早發(fā)型重度PE的發(fā)病機(jī)制,本研究采用免疫組化法檢測(cè)p62/SQSTM1在正常組、晚發(fā)重度PE組、早發(fā)重度PE組胎盤中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,p62/SQSTM1在正常組胎盤中表達(dá)最強(qiáng)(P<0.05),這同潘耀平等[16]研究結(jié)果一致,提示p62/SQSTM1可能參與早發(fā)型重度PE的病理過程,且胎盤中p62/SQSTM1的表達(dá)水平與PE的疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

        本研究結(jié)果還顯示:p62/SQSTM1與DAPK-1在PE胎盤組織的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)聯(lián),表明其在PE的發(fā)展中起協(xié)同作用,共同參與早發(fā)型重度PE的發(fā)生與發(fā)展過程。自噬是p62降解的原因,因此當(dāng)自噬異常損傷會(huì)導(dǎo)致p62大量的積累,進(jìn)而形成p62陽性聚集結(jié)構(gòu)和泛素[17];促炎細(xì)胞因子白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)能夠影響自噬基因的編導(dǎo)譜,自噬的PCR 陣列分別在胎盤外植體中響應(yīng)IL-6和TNF-α,顯著下調(diào)DAPK-1的水平[18]。當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞中DAPK1 mRNA和蛋白減少時(shí),自噬激活蛋白LC3B-I和-II增加,進(jìn)而使自噬相關(guān)蛋白p62減少。當(dāng)存在胎盤組織滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過度時(shí), 會(huì)影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵入、子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄不足,導(dǎo)致“胎盤淺著床”,使胎盤血液灌注量減少 ,導(dǎo)致子宮螺旋小動(dòng)脈血管發(fā)生血管重鑄不良,可能會(huì)進(jìn)一步致胎盤缺氧。胎盤缺氧可致使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,炎癥介質(zhì)的釋放以及抗凝物質(zhì)的聚集,引起的螺旋動(dòng)脈粥樣硬化,血管內(nèi)微血栓的形成,進(jìn)一步加重、促進(jìn)炎癥反應(yīng),加重細(xì)胞內(nèi)皮損傷,導(dǎo)致EP的發(fā)生與疾病的進(jìn)展。DAPK1是一種凋亡與自噬的調(diào)節(jié)劑,DAPK-1與P62共同參與PE的疾病進(jìn)展。DAPK-1表達(dá)增多,細(xì)胞凋亡機(jī)制受到激活,大量破碎的壞死滋養(yǎng)細(xì)胞增多,引發(fā)細(xì)胞自噬效應(yīng),可致P62參與的自噬過程激活,自噬體與溶酶體融合,細(xì)胞內(nèi)的P62等蛋白質(zhì)或細(xì)胞器被降解,釋放的部分物質(zhì)可誘導(dǎo)母體發(fā)生免疫反應(yīng),可能刺激其靶細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等炎性細(xì)胞因子可與DAPK-1進(jìn)入母體的血液循環(huán);以及同降解的破碎的細(xì)胞器或蛋白進(jìn)入母體血液循環(huán),致使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,誘發(fā)全身炎癥免疫反應(yīng)過度激活現(xiàn)象,全身小動(dòng)脈的痙攣,從而螺旋動(dòng)脈的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力受損和子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄極其不足,使胎盤血液灌注量減少,導(dǎo)致“胎盤淺著床”,引發(fā)PE。

        綜上,本研究的結(jié)果表明早發(fā)型重度PE胎盤中DAPK-1表達(dá)高、P62表達(dá)低,提示早發(fā)型重度PE的疾病嚴(yán)重程度更重,可能兩者共同參與了早發(fā)型重度PE的發(fā)生與發(fā)展;此外它們之間呈負(fù)相關(guān)聯(lián)系,可能在早發(fā)型重度PE的發(fā)病中起相互作用。

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