秦 瑛 雷小妹 岳珍妮 張金偉

1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(541100)；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院

宮頸癌是女性中常見的惡性腫瘤之一[1]。腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者治療失敗和死亡的主要原因[2]。尋找與宮頸癌惡性表型相關(guān)的靶標(biāo)對宮頸癌研究有重要價值。同源異形結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)化生長影響因子(TGIF)家族[3]在腫瘤[4]、代謝[5]和組織分化[6]等方面發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用。因子同源盒2(TGIF2)是TGIF家族中的重要成員之一[7]。研究已發(fā)現(xiàn)TGIF2在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且能夠抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[8]，非小細(xì)胞肺癌[9]，胃癌[10]，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移[11]等。然而，在宮頸癌中TGIF2的表達(dá)以及對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響少見報道。本研究探討TGF-β誘導(dǎo)的因子TGIF2在宮頸癌組織中的表達(dá)及對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

選擇2016年7月—2019年7月在本院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的76例宮頸癌患者宮頸癌組織標(biāo)本為觀察組，年齡(54.0±10.1)歲(35～76歲)；同期良性子宮肌瘤手術(shù)切除的65例正常宮頸組織為對照組，年齡(53.0±9.1)歲(36～71歲)。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療以及生物治療。本次研究已取得患者及其家屬知情同意書，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞(BH-C3294)購買于上海博湖生物科技有限公司；青鏈霉素(30-004-ci)購買于美國Corning公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(C11995500BT)、胎牛血清(1618862)購買于美國Gibco公司；胰蛋白酶(T2600000)購買于美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)、熒光定量PCR檢測試劑盒(DRR096A)購買于大連寶生物工程有限公司；iView DAB染色試劑盒(DA1015)購買于北京索萊寶科技有限公司；Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑(C0526)、MTT(ST316)、RIPA裂解液(P0013B)購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；siRNA-TGIF2、siRNA-NC由上海吉瑪制藥公司設(shè)計(jì)并合成；TGIF2抗體(ab190152，兔多克隆抗體)、Cyclin D1抗體(ab16663，兔多克隆抗體)、MMP2抗體(ab97779，兔多克隆抗體)、GAPDH抗體(ab181602，兔單克隆抗體)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)購買于上海艾博抗貿(mào)易有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將人宮頸癌HeLa細(xì)胞在含有10% FBS、雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃ 5% CO2，每3天換液1次。將狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中，每孔2×105個細(xì)胞。分組：空白對照組、TGIF2抑制(siRNA-TGIF2)組、陰性對照(siRNA-NC)組。分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別用100 μl無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋5 μl Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑和8 μl轉(zhuǎn)染物，室溫靜置5 min后混合，室溫靜置5 min。將混合物均勻滴加到孔內(nèi)輕輕混勻。置培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h后更換含有10% FBS、雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4 免疫組化染色實(shí)驗(yàn)

將宮頸癌組織、正常宮頸組織置多聚甲醛中固定，然后在不同濃度乙醇中脫水，石蠟包埋切片。置檸檬酸鹽緩沖液中，100℃ 5 min。加入一抗(1:100)，4℃過夜孵育。使用iView DAB染色試劑盒在自動載破片染色儀中檢測。

1.5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞中的RNA使用TRIzol試劑提取。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性30 s，35個循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(94℃ 5 s，60℃ 20 s)。以GAPDH為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計(jì)算TGIF2的相對表達(dá)量。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)

將狀態(tài)良好的宮頸癌HeLa細(xì)胞接種至96孔板中，每孔5×103個細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基。將siRNA-TGIF2、siRNA-NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基。加入0.5% MTT至孔中培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基。加入100 μl DMSO對甲瓚進(jìn)行溶解，室溫震蕩5 min。使用酶標(biāo)儀在490 nm處測定其OD值。

1.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

使用400 μl無血清培養(yǎng)基對50 μl Matrigel 基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋，并對Transwell小室底部膜進(jìn)行包被、水化。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為1×106cells/孔，在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁。吸去培養(yǎng)基。將siRNA-TGIF2、siRNA-NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基。使用胰酶消化HeLa細(xì)胞并用無血清培養(yǎng)基重懸，使用臺盼藍(lán)染色技術(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為5×105cells/L。取200 μl細(xì)胞懸液加至Transwell小室的上層，Transwell小室下層中加入500 μl 10%血清完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后取出小室，1×PBS清洗。4%多聚甲醛固定20 min，1×PBS清洗3次。使用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，1×PBS清洗后，每個小室隨機(jī)選擇5個視野，計(jì)數(shù)下室中染色的細(xì)胞以此來反應(yīng)細(xì)胞侵襲能力。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)

取處于對數(shù)生長期的宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為1×107cells/孔，在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)且細(xì)胞貼壁后，使用細(xì)胞刮在板上刮出2 cm寬無細(xì)胞區(qū)域，用1×PBS洗滌2次，在劃痕處做好標(biāo)記。分組：空白對照組、TGIF2抑制組、陰性對照組。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。棄上清，加入1 ml甲醇固定細(xì)胞5 min，棄甲醇。顯微拍照5張，計(jì)算并評估細(xì)胞遷移能力。

1.9 Western blot實(shí)驗(yàn)

將狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中，每孔2×105個細(xì)胞。分組：空白對照組、TGIF2抑制組、陰性對照組。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞并使用RIPA裂解液裂解。離心15 min獲得細(xì)胞中總蛋白通過BCA法測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE緩沖液電泳，轉(zhuǎn)膜。麗春紅染色后使用5%脫脂牛奶對PVDF膜進(jìn)行封閉。加入一抗(1:1000)，4℃孵育過夜。加入二抗(1:3000)室溫孵育1 h。清洗后使用ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光，通過Image J軟件分析相關(guān)條帶的光密度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中TGIF2的表達(dá)

TGIF2的陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)、部分定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒。TGIF2陽性表達(dá)率正常宮頸組織(18.5%，12/65)低于宮頸癌組織(81.6%，62/76)(χ2=46.363，P<0.05)。見圖1(2251頁)。

2.2 患者TGIF2表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系

TGIF2陽性表達(dá)與患者年齡、病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，而與腫瘤分化程度、FIGO分期有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 宮頸癌患者TGIF2表達(dá)與臨床指標(biāo)關(guān)系[例(%)]

2.3 轉(zhuǎn)染后各組 HeLa細(xì)胞TGIF2表達(dá)水平

與空白對照組(1.00±0.13)和陰性對照組(1.02±0.14)相比，TGIF2抑制組TGIF2 mRNA表達(dá)水平(0.46±0.06)降低(F=22.423，P<0.05)。與空白對照組(0.96±0.05)和陰性對照組(0.98±0.06)相比，TGIF2抑制組TGIF2蛋白表達(dá)水平(0.22±0.02)降低(F=250.832，P<0.05)。見圖2(2251頁)。

2.4 抑制TGIF2表達(dá)對各組 HeLa細(xì)胞增殖活性的影響

MTT檢測各時點(diǎn)各組HeLa細(xì)胞吸光度值，24 h后TGIF2抑制組HeLa細(xì)胞的吸光度值低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。見表3。

表3 各組不同時點(diǎn) HeLa細(xì)胞增殖活性比較

2.5 抑制TGIF2表達(dá)對各組 HeLa細(xì)胞遷移、侵襲的影響

穿膜細(xì)胞數(shù)，TGIF2抑制組(52.33±9.61)低于空白對照組(136.33±11.50)和陰性對照組(157.00±16.09)(F=57.183，P<0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染24 h后，TGIF2抑制組劃痕寬度(0.75±0.05)高于空白對照組(0.26±0.03)、陰性對照組(0.23±0.02)(F=220.091，P<0.05)。見圖3(2251頁)。

2.6 抑制TGIF2表達(dá)對各組 HeLa細(xì)胞cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)影響

TGIF2抑制組cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)水平(0.55±0.06、0.30±0.03)低于空白對照組(1.02±0.08、1.01±0.06)和陰性對照組(1.02±0.07、1.02±0.05)(Fcyclin D1蛋白=50.028，F(xiàn)MMP-2蛋白=217.100，均P<0.05)。見圖4(2251頁)。

3 討論

宮頸癌具有高發(fā)病率，高死亡率[12]。目前臨床上多采用手術(shù)治療和放化療治療，但因特異性不強(qiáng)，常會導(dǎo)致正常細(xì)胞受損，具有毒副作用大、療效差等缺點(diǎn)[13-14]。尋找能夠?qū)е聦m頸癌發(fā)生的特異性基因?qū)m頸癌診斷治療有重要研究意義。

TGIF2編碼的蛋白質(zhì)是一種與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，能夠通過多種方式參與腫瘤的調(diào)控作用[15]。Tian等[16]研究發(fā)現(xiàn)在皮膚癌中TGIF2能夠促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移。Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)通過負(fù)調(diào)節(jié)miR-129來上調(diào)TGIF2，進(jìn)而促進(jìn)人骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，與正常宮頸組織相比較，宮頸癌組織中TGIF2表達(dá)升高，且與腫瘤的分化程度相關(guān)，但與患者年齡、病理類型以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。這與TGIF2在皮膚癌[16]、膀胱癌[17]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞[8]、多發(fā)性骨髓瘤[18]中的表達(dá)結(jié)果相一致。

遷移和侵襲是腫瘤細(xì)胞主要惡性生物學(xué)行為，常導(dǎo)致治療失敗。Diao等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-129-5p通過靶向TGIF2能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251的增殖、遷移和侵襲能力，同時阻斷細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Lu等[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-541-3p通過靶向TGIF2抑制非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移；HU等研究[10]發(fā)現(xiàn)miR-34a通過靶向TGIF2抑制胃癌的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究以HeLa細(xì)胞株為研究對象，探究TGIF2的表達(dá)對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示TGIF2抑制組中TGIF2 mRNA表達(dá)量和蛋白含量均降低，功能性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力降低。

腫瘤細(xì)胞黏附能力減弱、腫瘤細(xì)胞與基底膜的緊密附著、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、腫瘤細(xì)胞通過基底膜鍵入血液循環(huán)等均是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的主要組成過程[19]?；|(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)在腫瘤的生長[20]、侵襲和轉(zhuǎn)移[21]、腫瘤血管形成[22]中有重要作用。細(xì)胞調(diào)控因子Cyclin D1不僅與細(xì)胞周期[23]相關(guān)，還有腫瘤的運(yùn)動有一定關(guān)系。宋文榮等[19]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1通過靶向miR-4262影響甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，與對照組和陰性對照組相比，TGIF2抑制組中MMP-2蛋白表達(dá)量及Cyclin D1蛋白含量降低，提示TGIF2可能通過抑制MMP-2、Cyclin D1表達(dá)而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，TGIF2在宮頸癌組織及HeLa細(xì)胞株中高表達(dá)，抑制TGIF2表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，TGIF2可能是促癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，有望為宮頸癌的治療提供一個新的靶點(diǎn)。