劉 瓊 張 欣 馮 燕 朱 琰

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院(200021)

子宮內(nèi)膜癌易發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性[1]。在我國(guó)發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第2位[2]?；瘜W(xué)療法是目前標(biāo)準(zhǔn)治療方法?；熕幬镯樸K為抗癌藥[3]。但患者可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)順鉑耐藥性，大大降低治療效果。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員14(KIF14)是潛在的致癌基因，參與各種癌癥轉(zhuǎn)移[4]。目前多數(shù)研究認(rèn)為，KIF14過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致快速且易出錯(cuò)的有絲分裂，從而在腫瘤發(fā)生過(guò)程中誘導(dǎo)非整倍性[5]；過(guò)表達(dá)的KIF14促進(jìn)惡性腫瘤，如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、前列腺癌和卵巢癌[6-8]。然而，關(guān)于KIF14在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生中的作用研究較少。因此，本研究通過(guò)分析KIF14基因?qū)樸K子宮內(nèi)膜癌耐藥細(xì)胞增殖、凋亡及順鉑敏感性的影響，探討子宮內(nèi)膜癌有效治療方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa、子宮內(nèi)膜癌順鉑耐藥細(xì)胞株Ishikawa/DDP(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；Trizol試劑盒、Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR green(美國(guó)Thermo公司)；siRNA-KIF14、siRNA-NC(美國(guó)圣克魯斯公司)；LipofectamineTM 2000 試劑盒(invitrogen公司)；RT-qPCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；ki-67兔單克隆抗體(ab9260，美國(guó)Merck公司)、KIF14兔多克隆抗體(ab71155)、Bax兔單克隆抗體(ab32503)、MDR1兔單克隆抗體(ab170904)、P-gp兔多克隆抗體(ab262880，英國(guó)Abcam公司)；β-actin兔單克隆抗體(#4970)、cleaved-Caspase-3兔單克隆抗體(#9661)、山羊抗兔IgG二抗(#7074，德國(guó)CST公司)。CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Bio Red公司)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)Thermo 公司)。

1.2 RT-qPCR和western-blot檢測(cè)KIF14表達(dá)

使用Trizol試劑盒提取子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa及子宮內(nèi)膜癌順鉑耐藥細(xì)胞株Ishikawa/DDP中的總RNA。通過(guò)Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用SYBR green在 CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行定量PCR。條件如下：95℃下熱循環(huán)10 min，95℃預(yù)變性30 s，變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，循環(huán)40次。以GAPDH作為內(nèi)參基因。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。采用2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物見(jiàn)表1。收集細(xì)胞，在具有蛋白酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液中裂解。用Pierce BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒確定蛋白質(zhì)樣品濃度。用等量蛋白質(zhì)通過(guò)10%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，將膜與KIF14兔多克隆抗體(1：5000)4℃孵育過(guò)夜。第二天室溫復(fù)溫1 h后用TBST洗滌后，加入山羊抗兔IgG二抗孵育(1：5000)。以β-actin作為內(nèi)參蛋白。使用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)，使用ImageJ軟件定量分析。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

表1 Real-time PCR引物

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

子宮內(nèi)膜癌順鉑耐藥細(xì)胞株Ishikawa/DDP和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa在10%胎牛血清(FBS)且含有鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞胰蛋白酶消化，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml，24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過(guò)夜，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到80%融合后轉(zhuǎn)染。用LipofectamineTM2000試劑盒轉(zhuǎn)染，將40 nM的siRNA-KIF14及siRNA-NC轉(zhuǎn)染Ishikawa/DDP細(xì)胞，作為si-KIF14組和si-NC組，其中耐藥組細(xì)胞不做處理。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋?zhuān)謩e接種含培養(yǎng)液皿中培養(yǎng)2～3周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)終止培養(yǎng)。棄上清液，4%多聚甲醛固定，GIMSA染色液染10～30 min。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。計(jì)算克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(3×106個(gè)/ml)離心棄培養(yǎng)液。PBS洗滌1次，加入冰預(yù)冷的70%乙醇4℃固定1 h。1000 r/min離心棄固定液，用PBS重懸5 min。400目篩網(wǎng)過(guò)濾后離心棄去PBS。加入PI染液染色，4℃避光30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.6 ki-67、Bax、cleaved-Caspase-3、MDR1、P-gp表達(dá)

用western-blot檢測(cè)相關(guān)蛋白，方法同1.2。其中ki-67、Bax、P-gp(1:2000)、cleaved-Caspase-3(1:1000)、MDR1(1:3000)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.7 順鉑敏感性

將各組細(xì)胞以104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中。24 h后，將細(xì)胞用順鉑(0、1、2、4、8、16、32、64 μg靏/ml)處理48 h MTT測(cè)定評(píng)估細(xì)胞活力。加入10 μl靗 MTT，孵育4 h后吸出培養(yǎng)基。每孔加入100 μl DMSO，以溶解結(jié)晶。用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)量吸光度。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 KIF14在順鉑耐藥細(xì)胞中的表達(dá)

與Ishikawa細(xì)胞(1.00±0.05、0.91±0.06)比較，子宮內(nèi)膜癌順鉑耐藥細(xì)胞株Ishikawa/DDP中KIF14 mRNA(2.37±0.14)和蛋白表達(dá)(1.50±0.08)均升高(P<0.001)。見(jiàn)圖1(2250頁(yè))。

2.2 KIF14轉(zhuǎn)染效果

si-KIF14組細(xì)胞KIF14 mRNA表達(dá)水平(0.28±0.03)低于耐藥組(1.00±0.06)和si-NC組(0.98±0.04)(P<0.001)。

2.3 干擾KIF14抑制順鉑耐藥細(xì)胞Ishikawa/DDP增殖

干擾KIF14后，與耐藥組(419±31、1.01±0.06)和si-NC組(432±35、0.98±0.06)比較，si-KIF14組細(xì)胞克隆形成數(shù)目(252±32)下降(P<0.01)，ki-67蛋白表達(dá)(0.15±0.02)下降(P<0.001)。見(jiàn)圖2(2250頁(yè))。

2.4 干擾KIF14促進(jìn)順鉑耐藥細(xì)胞Ishikawa/DDP凋亡

干擾KIF14后，Ishikawa/DDP細(xì)胞凋亡率(27.52±1.32)%，Bax及cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)(1.01±0.06、1.03±0.06)均高于與耐藥組[(4.29±1.07)%、0.50±0.05、0.81±0.06]和si-NC組[(4.81±1.06)%、0.51±0.06、0.79±0.07](P<0.05)。見(jiàn)圖3(2250頁(yè))。

2.5 干擾KIF14增加細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

不同濃度順鉑作用于細(xì)胞后，細(xì)胞IC50值耐藥組為13.71±0.75，si-NC組為13.14±0.24，si-KIF14組為7.32±0.31，si-KIF14組IC50值下降(P<0.001)；si-KIF14組多藥耐藥基因MDR1、P-gp蛋白表達(dá)(0.30±0.04、0.22±0.03)低于耐藥組(1.01±0.06、1.02±0.06)和si-NC組(1.02±0.06、1.01±0.06)(P<0.001)。見(jiàn)圖4(2250頁(yè))。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是最常見(jiàn)的女性癌癥之一[9]。放療、化學(xué)療法和激素療法可以單獨(dú)或聯(lián)合用于晚期患者[10]。晚期或復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后較差，1年生存率僅10%～20%?；瘜W(xué)療法被認(rèn)為是晚期或復(fù)發(fā)性宮頸癌標(biāo)準(zhǔn)治療方法，順鉑可有效治療該疾病，但可能會(huì)產(chǎn)生耐藥性抑制了治療功效[11]。因此，尋找預(yù)防和逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌順鉑耐藥性的有效途徑成為研究熱點(diǎn)。

KIF14基因是位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的驅(qū)動(dòng)蛋白家族蛋白的成員，研究發(fā)現(xiàn)KIF14與癌癥進(jìn)展有關(guān)，且常在各種腫瘤中過(guò)表達(dá)[12]。Li等[13]發(fā)現(xiàn)，KIF14在髓母細(xì)胞瘤中過(guò)表達(dá)，而KIF14的下調(diào)抑制了腫瘤的增殖并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。本研究也發(fā)現(xiàn)，與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa相比，KIF14在子宮內(nèi)膜癌順鉑耐藥細(xì)胞株Ishikawa/DDP中高表達(dá)。轉(zhuǎn)染后，si-KIF14組細(xì)胞KIF14 mRNA表達(dá)下降，表明轉(zhuǎn)染效果良好。另外KIF14與細(xì)胞的增殖、凋亡密切相關(guān)，Gerashchenko等[14]發(fā)現(xiàn)，KIF14水平在乳腺癌中升高且高表達(dá)與腫瘤分級(jí)和總生存期有關(guān)，敲低KIF14抑制了體外乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Qiu等[15]發(fā)現(xiàn)，KIF14與上皮性卵巢癌患者預(yù)后不良有關(guān)。Xu等[16]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA通過(guò)募集轉(zhuǎn)錄因子ETS1上調(diào)KIF14表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞侵襲和血管生成。在癌細(xì)胞中，KIF14可通過(guò)維持適當(dāng)水平的細(xì)胞粘附和細(xì)胞膜遷移蛋白來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移行為。因此，KIF14可能是腫瘤潛在治療靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，與耐藥組和NC組比，干擾KIF14后的Ishikawa/DDP細(xì)胞克隆形成數(shù)目和ki-67蛋白表達(dá)水平顯著下降，細(xì)胞凋亡率以及Bax、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，IC50值顯著下降，多藥耐藥基因MDR1、P-gp蛋白表達(dá)水平下降。提示干擾KIF14表達(dá)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌順鉑耐藥細(xì)胞Ishikawa/DDP增殖，促進(jìn)凋亡，并增加其對(duì)順鉑敏感性。

綜上所述，干擾KIF14表達(dá)能抑制子宮內(nèi)膜癌順鉑耐藥細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡并增加順鉑敏感性，提示干擾KIF14可能是治療子宮內(nèi)膜癌新靶點(diǎn)。然而關(guān)于干擾KIF14表達(dá)增加對(duì)順鉑敏感性作用機(jī)制尚需深入研究。