呂奎,賈祿強,戴京京,丁健*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(揚州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 揚州,225009)

甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母(methylotrophicPichiapastoris)是一種重要的重組蛋白表達系統(tǒng),與其他表達系統(tǒng)相比具有許多明顯的優(yōu)勢[1]。到2014年為止,超過1 000種重組蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中成功表達[2-3]。在畢赤酵母的甲醇代謝途徑中醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)扮演著十分重要的角色,AOX的合成是由AOX1和AOX2兩個基因控制,且兩者之間相互獨立,其中AOX1基因所編碼表達的酶量占據(jù)了總酶量的95%以上[4]。依據(jù)是否含有AOX1和AOX2基因可將甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母分為3類[5],其中最常用的有2類。第1類是同時含有AOX1和AOX2基因的甲醇利用快型菌(methanol utilization plusphenotype,Mut+)，此菌株在含甲醇的培養(yǎng)基中生長迅速、甲醇利用速度極快。因此,在甲醇誘導(dǎo)表達外源蛋白過程中需提供較高的甲醇補料速度和氧氣供應(yīng)速度。第2類是缺失AOX1基因的甲醇利用慢型菌(methanol utilization slow phenotype,MutS)，MutS畢赤酵母只能依靠AOX2基因編碼合成AOX,在含有甲醇培養(yǎng)基中生長速度較慢，甲醇和氧氣利用速度相對比較溫和[6]。

典型的畢赤酵母高密度發(fā)酵過程通常由細胞生長期(甘油分批培養(yǎng)/流加培養(yǎng))和甲醇誘導(dǎo)期(甲醇誘導(dǎo))兩個階段組成。其中,細胞生長期的目的是獲取高密度且功能健全的細胞[7-9],此階段面臨的主要難題是氧氣不足、甘油流加過量導(dǎo)致乙醇積累,本課題組針對這方面的困難提出策略A：用于細胞培養(yǎng)期的改良型DO-Stat甘油流加策略,該策略能夠在保證細胞快速生長的同時避免代謝副產(chǎn)物乙醇積累對細胞的毒害[8]。另一方面,甲醇誘導(dǎo)階段的主要目的是采用合理的甲醇誘導(dǎo)控制策略使目的蛋白的產(chǎn)量、活性或效價最大化，但在此誘導(dǎo)階段在通空氣供氧條件下,畢赤酵母細胞的高耗氧特性導(dǎo)致甲醇濃度和溶解氧(dissolved oxygen,DO)濃度相互影響和耦聯(lián),無法同時得到控制?？尚械目刂撇呗灾挥?個：即策略B：“甲醇濃度受限-溶氧濃度充足”(甲醇濃度～0 g/L,DO～10%)和策略C：“甲醇濃度充足-溶氧濃度受限”(甲醇濃度5-10 g/L,DO～0%)。本課題組前期研究分別比較了Mut+/MutS型畢赤酵母在上述2種現(xiàn)實可行誘導(dǎo)策略下的發(fā)酵性能。結(jié)果表明，使用策略B時可有效增強Mut+型畢赤酵母表達目的蛋白[10],而MutS型畢赤酵母表達目的蛋白時更加偏好策略C[6]。

綜合使用上述通用型控制策略,能夠滿足絕大多數(shù)畢赤酵母高密度發(fā)酵過程的工藝控制需求,將其推廣到更多的科研乃至工業(yè)生產(chǎn)中,將大大提高畢赤酵母高密度發(fā)酵過程的穩(wěn)定性和自動化水平。然而,若想推廣上述控制策略,需要極高的時間和人力成本,主要體現(xiàn)在以下2個方面：(1)軟件工程師需要深入各地的發(fā)酵生產(chǎn)現(xiàn)場,將運行上述控制策略所用的軟件系統(tǒng)安裝部署到工業(yè)控制計算機中；(2)各生產(chǎn)現(xiàn)場所使用的發(fā)酵設(shè)備各不相同,需要軟件工程師現(xiàn)場完成軟件系統(tǒng)與不同設(shè)備的對接。使用傳統(tǒng)的生物工程和發(fā)酵裝備技術(shù)難以解決上述問題,而互聯(lián)網(wǎng)及軟件技術(shù)的發(fā)展,卻能夠為通用型發(fā)酵控制策略的推廣提供新的思路和方法。本論文將基于Django框架搭建服務(wù)器[11],以http協(xié)議對外提供服務(wù),實現(xiàn)通用型畢赤酵母高密度培養(yǎng)策略的網(wǎng)絡(luò)共享,并依靠前期開發(fā)完成的客戶端程序?qū)崿F(xiàn)控制軟件包與不同發(fā)酵設(shè)備之間的對接。

1 材料與方法

1.1 畢赤酵母高密度培養(yǎng)

1.1.1 實驗菌株和培養(yǎng)基

菌株、種子培養(yǎng)基、分批發(fā)酵培養(yǎng)基、甘油流加培養(yǎng)基、甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基及山梨醇培養(yǎng)基與文獻[6]完全相同。

1.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)方法和誘導(dǎo)策略

種子培養(yǎng)方法及5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法與文獻[12]所用方法完全相同。

誘導(dǎo)策略I(甲醇濃度受限-溶氧濃度充足)：將DO設(shè)定值控制在10%，添加甲醇的同時，按照2∶1的質(zhì)量比流加山梨醇。在此過程中，不刻意控制甲醇濃度，受流加速率所限，甲醇濃度始終處于較低水平。并按照公式(1)計算甲醇流加速率：

F=F*+Kc×(DO-DOset)

(1)

式中：F，甲醇流加速率(F≥0)；F*，甲醇流加速率的基準值；F*，0.7 mL/min；Kc，0.05。

誘導(dǎo)策略II(甲醇濃度充足-溶氧濃度受限)：利用甲醇電極在線檢測甲醇濃度，并采用ON-OFF控制的方式將甲醇質(zhì)量濃度維持在5～10 g/L，同時按2∶1的質(zhì)量比流加山梨醇。在此過程中，不刻意控制DO。由于碳源供應(yīng)充足條件下O2被快速消耗，DO始終處于接近于0的水平。

1.1.3 分析測定方法

(1)細胞濃度測定

與文獻[6]所用方法相同。

(2)甲醇/山梨醇濃度測定

甲醇濃度測量方法見文獻[13]；山梨醇濃度的測量方法見文獻[14]。

(3)酶活力/蛋白質(zhì)量濃度的測定

HSA-GCSFm質(zhì)量濃度測定方法與文獻[15]所報告的方法相同。pIFN-α和hLYZ濃度測定與文獻[6]所用方法相同。hLYZ酶活力是參照《食品安全國家標準 食品添加劑 溶菌酶》(GB 1886.257—2016),以雞蛋清溶菌酶為標準品(比酶活力為20 000 U/mg)測量得出。Cap蛋白質(zhì)量濃度的測定方法是按照文獻[6]所指出的方法進行測定。

1.2 發(fā)酵數(shù)據(jù)管理及工藝控制服務(wù)器開發(fā)

Django是利用Python開發(fā)的一套開源Web框架[16],采用模型(Model)-模板(Template)-視圖(View)的MVC設(shè)計模式[17],是目前最常用的服務(wù)器框架,可以高效地開發(fā)服務(wù)器程序。本研究使用Django框架,開發(fā)專用于發(fā)酵過程數(shù)據(jù)管理與工藝控制的服務(wù)器程序，如圖1所示。用戶可以通過http請求訪問服務(wù)器,Url模塊根據(jù)訪問路徑將用戶請求分發(fā)至Views模塊的指定函數(shù)中,View模塊中的業(yè)務(wù)處理函數(shù)負責處理用戶請求(如用戶登錄、保存發(fā)酵數(shù)據(jù)、下載指定擴展軟件包等),利用Model模塊以對象關(guān)系映射(object relational mapping,ORM)方式與MySQL數(shù)據(jù)庫,最終將業(yè)務(wù)處理的結(jié)果返回給用戶。

圖1 Django服務(wù)器框架Fig.1 Django server framework

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵數(shù)據(jù)管理及工藝控制服務(wù)器功能實現(xiàn)

基于Django框架開發(fā)的服務(wù)器程序,提供了一系列與發(fā)酵過程數(shù)據(jù)管理及工藝控制相關(guān)的應(yīng)用程序接口(application programming interface,API),主要包括用戶操作(如用戶登錄、退出等)、數(shù)據(jù)操作(如發(fā)酵批次管理、上傳數(shù)據(jù)、查詢數(shù)據(jù)等)、權(quán)限操作(如發(fā)酵批次授權(quán)、取消授權(quán)等)以及擴展軟件包操作(如工藝控制軟件包的下載、更新等)。在阿里云平臺租用一臺具有公網(wǎng)IP的服務(wù)器主機(操作系統(tǒng)為Centos 7),并為其綁定域名。將本研究中開發(fā)的服務(wù)器程序部署在云主機上,即可對外提供API訪問的服務(wù)。本課題組前期開發(fā)的PC客戶端程序,已經(jīng)提供了完善的連接設(shè)備功能,只需要在軟件中進行簡單的通信參數(shù)設(shè)置,就可以與生產(chǎn)現(xiàn)場的不同發(fā)酵設(shè)備成功對接,解決了軟件系統(tǒng)與發(fā)酵設(shè)備對接的難題[18]。在圖2所示的系統(tǒng)架構(gòu)下,用戶借助PC客戶端程序訪問服務(wù)器所提供的API,即可實現(xiàn)用戶操作、數(shù)據(jù)操作、權(quán)限操作和擴展軟件包的操作。在云服務(wù)器程序提供的各項功能中,值得重點關(guān)注的是擴展軟件包的操作功能,利用該功能可以實現(xiàn)發(fā)酵策略的網(wǎng)絡(luò)共享。在以下的研究中,將在實際的畢赤酵母發(fā)酵過程中,驗證通用型控制策略的網(wǎng)絡(luò)共享功能。

圖2 實現(xiàn)控制策略網(wǎng)絡(luò)共享的系統(tǒng)架構(gòu)Fig.2 System framework for sharing control strategy with internet

2.2 細胞培養(yǎng)階段甘油流加策略的網(wǎng)絡(luò)共享

將前期研究中構(gòu)建的改良型DO-Stat甘油流加策略編寫成與PC客戶端兼容的擴展軟件包,將其保存在云端MySQL數(shù)據(jù)庫中,并將下載該軟件包的權(quán)限授予指定用戶。用戶在發(fā)酵現(xiàn)場運行的PC客戶端上輸入用戶名和密碼登錄系統(tǒng),客戶端程序?qū)訮OST方式訪問用戶登錄功能所對應(yīng)的API地址,即“http://{hostname}/users/userlogin/”,并提交用戶輸入的用戶名和密碼,登錄成功后將返回代表用戶合法身份的token(令牌)。用戶可將云端數(shù)據(jù)庫中存儲的改良型DO-Stat甘油流加策略擴展軟件包下載至本地客戶端,軟件包的下載由PC客戶端以POST方式訪問“http://{hostname}/packages/improvedostat/”來實現(xiàn)。客戶端需提交合法的token,服務(wù)器程序才能通過用戶權(quán)限驗證,允許用戶下載指定的擴展軟件包。下載至本地工業(yè)控制計算機的擴展軟件包,可以在PC客戶端中被調(diào)用,利用改良型DO-Stat策略實現(xiàn)甘油的自動流加。

在發(fā)酵現(xiàn)場的PC客戶端上調(diào)用上述從云端下載的擴展軟件,用于Mut+型畢赤酵母細胞培養(yǎng)階段的甘油流加控制,控制性能可由PC客戶端的曲線監(jiān)控界面直觀地展示(圖3)。整個細胞培養(yǎng)期共分為如下的幾個階段：(1)分批培養(yǎng)階段：培養(yǎng)起始時刻,通空氣供氧,將攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)為250 r/min,每當DO低于20%,攪拌轉(zhuǎn)速提高50 r/min,直至初始培養(yǎng)基中的甘油耗盡。此階段大約持續(xù)14 h(數(shù)據(jù)未顯示),之后開始流加甘油。(2)以空氣供氧的甘油流加階段：啟動改良型DO-Stat甘油流加擴展軟件包,該軟件包可根據(jù)PC客戶端在線采集到的DO濃度和乙醇濃度自動計算出每次甘油流加的持續(xù)時間,并自動實施甘油流加。在此期間,仍然以空氣供氧,每當DO基線低于20%,攪拌轉(zhuǎn)速提高50 r/min,直到攪拌轉(zhuǎn)速達到最大值(700 r/min),此階段大約持續(xù)8 h。(3)以純氧供氧的甘油流加階段：培養(yǎng)22 h后,盡管已經(jīng)將攪拌轉(zhuǎn)速提升到了設(shè)備所能承受的最大值,但DO的基線仍然處于較低水平。

圖3 改良型DO-Stat擴展包控制性能Fig.3 Control performance of improved DO-Stat package注：圖中數(shù)據(jù)均為標準化后的數(shù)據(jù)：轉(zhuǎn)速=顯示值/100×1 000,溶解氧濃度=顯示值/100×200,細胞濃度=顯示值/100×1 000

這說明通空氣已經(jīng)無法滿足畢赤酵母對O2的需求,因此通入純氧(1 vvm)代替空氣,改良型DO-Stat甘油流加程序照常運行。在此過程中,仍然需要調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速,使DO基線始終處于合理的范圍內(nèi)。培養(yǎng)至26 h后,發(fā)酵液OD值達到407,已經(jīng)能夠滿足甲醇誘導(dǎo)的需要。

從以上的研究結(jié)果中可以看出,不論是在通空氣還是在通純氧供氧的條件下,PC客戶端通過網(wǎng)絡(luò)共享獲得的改良型DO-Stat擴展軟件包都能夠正常運行,性能穩(wěn)定。在甘油自動流加期間,細胞濃度持續(xù)快速增長,直至滿足甲醇誘導(dǎo)的需要。MutS型畢赤酵母利用甘油的特性與Mut+型畢赤酵母類似,因此改良型DO-Stat擴展軟件包也可用于MutS型畢赤酵母的細胞培養(yǎng)階段,同樣能夠取得良好的效果,具體的培養(yǎng)性能數(shù)據(jù)這里不再贅述。

經(jīng)過細胞培養(yǎng)階段后,獲得了較高的細胞濃度(OD>400),之后則需要開始添加甲醇,誘導(dǎo)目的蛋白的表達。前期研究表明,Mut+和MutS兩種類型的菌株利用甲醇的特性差異較大,因此在其甲醇誘導(dǎo)階段應(yīng)該采取不同的甲醇流加策略[12]。在Mut+型菌株的誘導(dǎo)過程中,通常采用“甲醇濃度受限-溶氧濃度充足”誘導(dǎo)控制策略；在MutS型菌株的誘導(dǎo)過程中,通常采用“甲醇濃度充足-溶氧濃度受限”誘導(dǎo)控制策略。

2.3 Mut+型甲醇誘導(dǎo)策略的網(wǎng)絡(luò)共享

對于Mut+型菌株,在誘導(dǎo)階段采用“甲醇濃度受限-溶氧濃度充足”甲醇流加策略更有利于外源蛋白的高效表達。先將“甲醇濃度受限-溶氧濃度充足”誘導(dǎo)控制策略開發(fā)成擴展軟件包,將其保存于云端數(shù)據(jù)庫中。PC客戶端以POST方式訪問“http://{hostname}/packages/lowmethnol/”,提交合法的token,從云端將擴展軟件包下載至本地工業(yè)控制計算機中。本研究以表達HSA-GCSFm的Mut+型畢赤酵母作為研究對象。待細胞生長期將Mut+型菌株經(jīng)過25～30 h的細胞培養(yǎng)階段后,發(fā)酵液OD值可以達到400以上。停止流加甘油,通過1～2 h的“饑餓培養(yǎng)”將發(fā)酵液內(nèi)的甘油消耗殆盡,此時DO開始急劇上升,應(yīng)將純氧切換回空氣進行通氣并向罐內(nèi)加入少量甲醇,等到DO下降,細胞開始適應(yīng)甲醇的存在,開始進入甲醇誘導(dǎo)階段。此時,利用PC客戶端調(diào)用“甲醇濃度受限-溶氧濃度充足”誘導(dǎo)控制策略擴展軟件包,在整個誘導(dǎo)期間實施甲醇的自動流加。在此過程中,本控制系統(tǒng)可以利用PC客戶端采集實時數(shù)據(jù),并以曲線圖的方式監(jiān)測整個工藝執(zhí)行過程,結(jié)果如圖4所示。

圖4 “甲醇濃度受限-溶氧濃度充足”誘導(dǎo)控制策略擴展包控制性能Fig.4 Control performance of “l(fā)ow methanol concentration-high DO” induction control strategy package注：圖中數(shù)據(jù)均為標準化后的數(shù)據(jù)：轉(zhuǎn)速=顯示值/100×1 000,溶解氧濃度=顯示值/100×100,甲醇濃度=顯示值/100×100

在PC客戶端的控制下,上述誘導(dǎo)控制策略可順利實施,在“甲醇濃度受限-溶氧濃度充足”的優(yōu)誘導(dǎo)控制策略下,誘導(dǎo)60 h后HSA-GCSFm的質(zhì)量濃度達到532 mg/L較優(yōu)水平。圖5顯示了在“甲醇濃度受限-溶氧濃度充足”誘導(dǎo)控制策略實施下Mut+型畢赤酵母表達HSA-GCSFm過程中的發(fā)酵生產(chǎn)性能。

圖5 “甲醇濃度受限-溶氧濃度充足”誘導(dǎo)控制策略下,Mut+型畢赤酵母表達HSA-GCSFm的發(fā)酵生產(chǎn)性能Fig.5 The fermentation performance of Mut+Pichia pastoris expressing HSA-GCSFm under the “l(fā)ow methanol concentration-high DO” induction control strategy

從上述研究實例中可以看出,利用云服務(wù)器、通過互聯(lián)網(wǎng)共享發(fā)酵工藝控制軟件包是完全可行的。利用該技術(shù)可以實現(xiàn)發(fā)酵工藝控制軟件包的遠程部署安裝,大大降低其推廣安裝成本,促進發(fā)酵生產(chǎn)過程的自動化和信息化轉(zhuǎn)型。

2.4 MutS型甲醇誘導(dǎo)策略的網(wǎng)絡(luò)共享

與改良型DO-Stat策略擴展軟件包的共享方式相同,先將“甲醇濃度充足-溶氧濃度受限”誘導(dǎo)控制策略開發(fā)成擴展軟件包,將其保存于云端數(shù)據(jù)庫中。PC客戶端以POST方式訪問“http://{hostname}/packages/highmethanol/”,提交合法的token,從云端將擴展軟件包下載至本地工業(yè)控制計算機中。將使用表達重組人源溶菌酶的MutS型畢赤酵母作為研究對象，在細胞生長期將MutS培養(yǎng)至至所需濃度(OD>400)且經(jīng)過一段饑餓培養(yǎng)后,進入甲醇誘導(dǎo)階段。此時,利用PC客戶端調(diào)用“甲醇濃度充足-溶氧濃度受限”誘導(dǎo)控制策略擴展軟件包,在整個誘導(dǎo)期間實施甲醇的自動流加。在工藝執(zhí)行期間,可以利用PC客戶端采集實時數(shù)據(jù),并以曲線圖的方式監(jiān)測整個工藝執(zhí)行過程,結(jié)果如圖6所示。

圖6 “甲醇濃度充足-溶氧濃度受限”誘導(dǎo)策略擴展包控制性能Fig.6 Control performance of “high methanol concentration-low DO” induction strategy package注：圖中數(shù)據(jù)均為標準化后的數(shù)據(jù):轉(zhuǎn)速=顯示值/100×1000,溶解氧濃度=顯示值/100×100,甲醇濃度=顯示值/100×15

在PC客戶端的控制下,上述控制策略順利實施,經(jīng)過69 h的甲醇誘導(dǎo),參照GB 1886.257—2016《食品安全國家標準 食品添加劑 溶菌酶》,以雞蛋清溶菌酶標準品(比酶活力為20 000 U/mg),對重組畢赤酵母表達的人源溶菌酶活力進行檢測。誘導(dǎo)69 h后總酶活平均值為84 032.0 U/mg,對應(yīng)的比酶活力為52 884.0 U/mg的較優(yōu)水平。圖7顯示了在“甲醇濃度充足-溶氧濃度受限”控制策略實施下MutS型畢赤酵母表達hLYZ過程中的發(fā)酵生產(chǎn)性能。

圖7 “甲醇濃度充足-溶氧濃度受限”誘導(dǎo)控制策略下,MutS型畢赤酵母表達hLYZ的發(fā)酵生產(chǎn)性能Fig.7 Fermentation performance of MutS Pichia pastoris expressing hLYZ under the “high methanol concentration-low DO” induction control strategy

2.5 通用型畢赤酵母高密度培養(yǎng)策略的網(wǎng)絡(luò)共享系統(tǒng)通用性/可重復(fù)性驗證

為了驗證本系統(tǒng)是否具有一定的通用性/可重復(fù)性,在利用Mut+型畢赤酵母生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒Cap蛋白(Cap蛋白)和利用MutS型畢赤酵母生產(chǎn)豬α干擾素(pIFN-α)的過程中也分別采用上述網(wǎng)絡(luò)共享系統(tǒng)進行發(fā)酵。如表1所示,結(jié)果顯示出了此系統(tǒng)使用后較高的外源蛋白產(chǎn)量和良好的通用性,驗證了此網(wǎng)絡(luò)共享系統(tǒng)的通用性/可重復(fù)性。

表1 網(wǎng)絡(luò)共享系統(tǒng)通用性/可重復(fù)性驗證Table 1 Verification of commonality/repeatability of network sharing system

3 結(jié)論

本文在研究室前期已經(jīng)構(gòu)建了一系列適用于甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母高密度培養(yǎng)過程的通用型控制策略的基礎(chǔ)上,基于Django框架搭建服務(wù)器,實現(xiàn)通用型畢赤酵母高密度培養(yǎng)策略的網(wǎng)絡(luò)共享,并依靠前期開發(fā)完成的客戶端程序?qū)崿F(xiàn)控制軟件包與不同發(fā)酵設(shè)備之間的對接。并以表達HSA-GCSFm的Mut+型菌株和表達hLYZ的MutS型畢赤酵母為模式菌株對上述網(wǎng)絡(luò)共享的通用型畢赤酵母高密度培養(yǎng)策略進行了驗證：利用云服務(wù)器、通過互聯(lián)網(wǎng)共享發(fā)酵工藝控制軟件包,在生長期實施改良型DO-Stat甘油流加策略,誘導(dǎo)期分別實施“甲醇濃度受限-溶氧濃度充足”和“甲醇濃度充足-溶氧濃度受限”誘導(dǎo)控制策略。結(jié)果表明：Mut+型畢赤酵母誘導(dǎo)60 h后HSA-GCSFm的濃度達到532 mg/L；MutS型畢赤酵母誘導(dǎo)69 h后hLYZ總酶活力平均值為84 032.0 U/mg,對應(yīng)的比酶活力為52 884.0 U/mg。上述2種目的蛋白的濃度/效價均達到較高水平,驗證了此網(wǎng)絡(luò)共享系統(tǒng)的可行性/可重復(fù)性,促進發(fā)酵生產(chǎn)過程的自動化和信息化轉(zhuǎn)型。