耿嘉鈺，程煥,2，張惠玲*

1(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川，750021)2(浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，智能食品加工技術(shù)與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室，浙江省健康食品制造與品質(zhì)控制國際合作基地，浙江大學(xué)馥莉食品研究院，浙江 杭州，310058)

枸杞(LyciumbarbarumL.)作為傳統(tǒng)藥食兩用植物，已逐漸成為健康食品并被國內(nèi)外市場接受[1]。研究顯示，枸杞除多糖、甜菜堿和維生素外，還富含多酚類物質(zhì)，因此具有較強的抗氧化、降低膽固醇的能力[2]。枸杞中多酚類物質(zhì)主要包括酚酸、花青素[3]、酚酸與多胺形成的酚酸酰胺等植物次生代謝物及其復(fù)合物[4-5]。枸杞酒作為枸杞深加工中發(fā)展最迅速的產(chǎn)品之一，逐漸被更多消費者接受[6]。枸杞發(fā)酵酒酒精含量低，在保留枸杞原有的營養(yǎng)成分基礎(chǔ)上，還具有典型性香氣特征，十分適合貧血、睡眠質(zhì)量不佳的人群飲用[7]。酚酸在微生物的作用下轉(zhuǎn)化為酒的重要香氣成分，其中的芳香族化合物通過酵母菌發(fā)酵從兒茶素、綠原酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸等物質(zhì)中轉(zhuǎn)化而來[8]。MATHEW等[9]研究顯示，阿魏酸可以被酵母菌、霉菌和細菌轉(zhuǎn)化為具有特殊香氣的4-乙烯基苯酚和香蘭素。

目前對枸杞中酚酸物質(zhì)的研究多集中于酚酸物質(zhì)的提取、鑒定和抗氧化能力等方面。呂海洋等[10]在寧夏枸杞中鑒定出28種多酚類物質(zhì)，并首次鑒定出7種香豆酸糖苷衍生物;INBARAJ等[11]研究發(fā)現(xiàn)，寧夏枸杞含有槲皮素、酚酰胺及香豆酸化合物，其種類和含量都很豐富；而FORINO等[12]首次在枸杞中發(fā)現(xiàn)阿魏酸與酪胺形成的二聚體，并認為是枸杞中含量最高的酚類物質(zhì);ISABEL等[13]用四級桿串聯(lián)飛行時間譜從寧夏枸杞中鑒定出包括綠原酸、對香豆酸、槲皮素及其衍生物等31種多酚類化合物；RODRIGUES等[14]測定了枸杞干果和枸杞膠囊中多酚的組成，發(fā)現(xiàn)共有8種具有生物活性的酚酸和2種黃酮類化合物，含量分別為55.5～83.7 mg/kg和172.3～2 982.4 mg/kg。目前，人們對酚酸單體物質(zhì)在枸杞酒發(fā)酵過程中的變化研究較少，因此本實驗通過研究不同預(yù)處理及發(fā)酵過程中酚酸的降解情況，探究枸杞酒釀造過程中酚酸含量的變化及其相應(yīng)降解產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

枸杞，寧夏百瑞源枸杞股份有限公司；果膠酶(酶活力≥60 000 U/g)，浙江博丹衡食品配料有限公司；偏重亞硫酸鈉，食品級，河南千志商貿(mào)有限公司；白砂糖，食品級，當(dāng)?shù)爻?；法國釀酒干酵母，法國Lamothe-Abiet公司。

1.1.2 實驗試劑

環(huán)己醇(色譜純)、無水乙醇(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、正己烷(色譜純)、二氯甲烷(色譜純)、丙酮(色譜純)、甲酸(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；色譜級酚酸標(biāo)準品包括兒茶酸、咖啡酸、香豆酸、綠原酸、丁香酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸，阿拉丁(中國，上海)試劑公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

MS105DU電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；DT35手持糖度儀，上海淋譽公司；SHJ-6AB磁力攪拌水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；3K15離心機，美國Sigma-Aldrich公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Waters e2695高效液相色譜分析儀，美國Waters公司；手動固相微萃取(SPME)裝置，美國Supelco公司；Agilent7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；PB-LO pH計，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；JYK-C051九陽榨汁機，中國杭州九陽小家電有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞汁的制備

枸杞干果用蒸餾水沖洗干凈，料液比為1∶5(g∶mL)，加入54 mg/L的偏重亞硫酸鈉，浸泡6 h后打漿，加入40 mg/L的果膠酶于40 ℃恒溫水浴4 h，分裝于錐形瓶中備用。

1.2.2 枸杞汁預(yù)處理條件設(shè)定

枸杞酒釀造前，必須對枸杞汁先進行預(yù)處理，即酶解、滅菌、調(diào)節(jié)pH。參考趙璐[15]的方法對5個不同預(yù)處理條件進行分析，實驗均在避光以及充CO2隔氧的條件下進行，并立即分別取10 mL樣品置于棕色瓶中封口待測。

對照組：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后立即取樣測定。

果膠酶處理組：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后，按比例加入40 mg/L果膠酶酶解2 h后取樣。在此期間保證燒杯充滿CO2。

調(diào)節(jié)pH組：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后，測得原汁的pH為4.8，用檸檬酸調(diào)整其pH為3.3后取樣。

高壓滅菌組：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后，在0.10～0.15 MPa，121～126 ℃滅菌條件下滅菌30 min后立即取樣測定。

偏重亞硫酸鈉組(SO2滅菌組)：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后，加入54 mg/L偏重亞硫酸鈉，使游離SO2的質(zhì)量濃度達到60 mg/L，放置1 h后立即取樣測定。

光照處理組：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后，然后放置在自然光下分別照射1、2、3、4 h，分別取樣測定。

1.2.3 枸杞酒的釀造

取1.2.1小節(jié)中制備的枸杞汁，調(diào)節(jié)糖度為25°Bx，pH為3.3，接種酵母(0.20 g/L)，18 ℃發(fā)酵，每天取樣進行糖度、pH值和酒精度的測定，數(shù)值穩(wěn)定時終止發(fā)酵。取發(fā)酵后的酒樣存于-80 ℃冰箱待測。

1.2.4 酚酸含量測定

參考馬先紅等[16]和ADOM等[17]的方法，并做適當(dāng)修改。準確稱取10 mL枸杞汁或枸杞酒樣品于50 mL離心管中，加入30 mL 體積分數(shù)為80%冰乙醇后于搖床振蕩提取15 min。提取結(jié)束后在2 500 r/min離心10 min。移出上清液，殘渣再提取2次，合并3次上清液，用0.45 μm濾膜過濾。將過濾后的上清液放置在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，設(shè)置45 ℃，在真空條件下蒸干，并用甲醇定容至10 mL。使用0.22 μm濾膜過濾后保存于-80 ℃，用于酚酸物質(zhì)含量的測定。

使用高效液相色譜(hight performance liguid chromatography,HPLC)系統(tǒng)測定枸杞汁或枸杞酒中酚酸含量：色譜條件參考WU等[18]的方法并作適當(dāng)修改。取酚酸提取液與混和標(biāo)準品溶液分別注射10 μL于HPLC系統(tǒng)中，反相C18柱(ZORABX SB-C18,250 mm×4.6 mm)用于色譜分離。使用雙流動相梯度洗脫，包括甲醇(A相)和體積分數(shù)為0.1%甲酸水溶液(B相)，洗脫程序為：0～8 min,15%～20% A;8～18 min,20%～60% A;18～30 min,60%～80% A;30～40 min,80% A;40～50 min,80%～15% A。流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長設(shè)為288和330 nm。通過對比各標(biāo)準品的保留時間和峰面積，確定樣品中酚酸的組成和含量。

1.2.5 酚酸標(biāo)準曲線繪制

避光準確稱取兒茶素、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸標(biāo)準品各2.00 mg，分別溶于冰乙醇中，待樣品完全溶解，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，4 ℃儲存待用。進樣前進行梯度稀釋，并以各物質(zhì)質(zhì)量濃度為X軸，峰面積為Y軸建立線性回歸方程，結(jié)果如表1所示。

表1 酚酸線性回歸方程Table 1 Phenolic acid linear regression equation

1.2.6 建立模擬體系

以單純的酵母菌在糖液中發(fā)酵做模擬體系，分別加入酚酸標(biāo)準品進行酵母菌發(fā)酵，測定發(fā)酵后物質(zhì)的變化與降解產(chǎn)物。參考文獻[19]的方法配制與枸杞酒發(fā)酵環(huán)境相似的YPD培養(yǎng)基，準確稱取蛋白胨20 g/L，加入1 000 mL蒸餾水，添加適量葡萄糖將培養(yǎng)基糖度調(diào)整為糖度25°Bx，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為3.3，121 ℃高壓滅菌30 min后冷卻到18 ℃左右。在無菌條件操作下，分別加入0.50 g各個酚酸標(biāo)準品，接種酵母(0.2 g/L)于YPD培養(yǎng)基中，震蕩搖勻后，于18 ℃恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液糖度不再變化，終止發(fā)酵，取樣待測。

1.2.7 酚酸降解的揮發(fā)性物質(zhì)測定

1.2.7.1 GC-MS分析[1]

色譜條件：DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度為250 ℃，解吸時間5 min，用于GC-MS分析。載氣為高純氦氣(99.999%)，氣體流量為1.5 mL/min，不分流。程序升溫：起始溫度35 ℃，保持3 min；以3 ℃/min的升溫速度升至40 ℃，保持1 min；再以5 ℃/min的升溫速度升至210 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度270 ℃，離子源溫度為230 ℃，EI為電離源，電子能量為70 eV，燈絲流量為0.20 mA，檢測器電壓為350 V，掃描范圍為45～450 Amu。

1.2.7.2 定性定量分析

定性分析：分析結(jié)果運用NIST譜庫進行初步檢索和分析，再結(jié)合相關(guān)文獻進行人工譜圖解析，進而確認各個待測組分的化學(xué)組成。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)環(huán)己酮(質(zhì)量濃度為0.285 μg/mL)進行相對定量分析。即假設(shè)各物質(zhì)響應(yīng)頻率和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)相同，通過待測組分與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積之比，計算待測物質(zhì)的含量(μg·mL-1)。計算方法如公式(1)：

待測物質(zhì)質(zhì)量濃度=

(1)

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0和Excel分析和處理數(shù)據(jù)，單向方差分析(ANOVA)區(qū)分樣品之間的顯著差異，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中酚酸單體分析

通過對照標(biāo)準品與高分辨質(zhì)譜分析，從枸杞汁和枸杞酒色譜峰中共確定了7種酚類物質(zhì)單體。根據(jù)相應(yīng)化合物的標(biāo)準曲線方程，計算7種酚酸單體的含量，如表2所示。

表2 枸杞酒中酚酸物質(zhì)組成及顯著性分析 單位：μg/mL

實驗結(jié)果顯示，7種酚酸單體物質(zhì)在發(fā)酵前期(0～4 d)含量呈上升趨勢，在發(fā)酵第4～5 天達到峰值。原因是發(fā)酵前期，酵母菌大量繁殖，釋放出大量酶,使得枸杞汁中的酚酸物質(zhì)釋放出來，從而使得各單體酚酸含量上升。發(fā)酵中期(4～6 d)時，因為酚酸結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，極易受外界環(huán)境如發(fā)酵溫度、光照、氧化等影響發(fā)生降解[21]，且隨著酚酸物質(zhì)不斷氧化縮合，各單體酚酸含量均出現(xiàn)下降趨勢。而在發(fā)酵后期(6～12 d)，發(fā)酵體系達到穩(wěn)定狀態(tài)，因此酚酸含量變化不大。

2.2 不同預(yù)處理對酚酸物質(zhì)的影響

2.2.1 對酚酸含量的影響

由圖1看出，與對照組相比，調(diào)節(jié)pH時，只有咖啡酸含量變化較為明顯，增長約為3.06倍；果膠酶處理組中有咖啡酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸和丁香酸的含量變化明顯，其含量分別增長約為5.78、3.34、2.60和2.50倍；光照處理時，只有咖啡酸含量變化較為明顯，增長約為2.67倍；高壓滅菌處理時咖啡酸、阿魏酸和兒茶素的含量變化明顯，其含量分別增長約為10.48、6.00和3.12倍；SO2滅菌時只有咖啡酸含量變化較為明顯，增長約為3.37倍。

圖1 不同預(yù)處理對枸杞汁中酚酸含量的影響Fig.1 Effects of different pretreatments on phenolic acid content in goji juice

2.2.2 枸杞汁中酚酸降解產(chǎn)物

由表3看出，5個不同條件下都測到了降解產(chǎn)物，其中酚酸經(jīng)過果膠酶處理后生成的降解產(chǎn)物種類最多，分別為2,5-二甲基吡嗪、苯乙酮、4-乙基愈創(chuàng)木酚、苯乙酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、丙酸和異丁酸乙酯。偏重亞硫酸鈉組次之，產(chǎn)生了2,5-二甲基吡嗪苯乙酮4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,4-二叔丁基苯酚、丙酸、異丁酸乙酯；高壓滅菌處理后的枸杞汁，檢測到的酚酸降解產(chǎn)物最少，只有2,5-二甲基吡嗪、苯乙酮和2,4-二叔丁基苯酚。說明果膠酶破壞分子鍵的化學(xué)作用和偏重亞硫酸鈉的還原作用，比高壓滅菌的物理作用強。

2.3 枸杞酒發(fā)酵中酚酸變化規(guī)律

由表4看出，發(fā)酵前后，酚酸中含量變化最大的是咖啡酸，其次是丁香酸，變化最小的是兒茶素。說明雙鍵含量越多，越不穩(wěn)定。實驗測定含量相對較多的降解物有6種，分別為2,5-二甲基吡嗪、苯乙酮、4-

表3 不同預(yù)處理條件下酚酸降解產(chǎn)物 單位：μg/mL

乙基愈創(chuàng)木酚、苯乙酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚和乙酸異戊酯。7種酚酸都在最不穩(wěn)定的雙鍵位置斷裂，同時容易在羰基被還原、羥基被氧化，產(chǎn)生了降解物和與降解相關(guān)的物質(zhì)。

表4 枸杞酒發(fā)酵中酚酸變化規(guī)律Table 4 Changes of phenolic acid in fermentation of goji wine

續(xù)表4

2.4 模擬體系中酚酸的降解產(chǎn)物分析

由表4和表5比較分析，發(fā)酵模擬體系與枸杞酒中酚酸單體降解產(chǎn)物種類相同，含量的數(shù)據(jù)基本吻合，模擬體系中酚酸降解產(chǎn)物有9種，枸杞酒發(fā)酵后的酚酸降解產(chǎn)物有8種，兩者有差異的原因可能是枸杞酒發(fā)酵前預(yù)處理或發(fā)酵環(huán)境引起的。

表5 模擬體系中酚酸降解產(chǎn)物分析Table 5 Analysis of phenolic acid degradation products in simulated systems

3 結(jié)論

本研究對枸杞酒釀造過程中不同預(yù)處理條件和發(fā)酵過程中酚酸含量及降解產(chǎn)物的變化進行測定，發(fā)現(xiàn)酚酸在枸杞酒釀造過程中，因其含有多不飽和雙鍵、酯鍵、羥基基團，不穩(wěn)定因素非常多，容易發(fā)生降解、氧化、還原反應(yīng)，產(chǎn)生2,5-二甲基吡嗪、苯乙酮、4-乙基愈創(chuàng)木酚、丙酸、苯乙酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、4-甲氧基苯乙烯和乙酸異戊酯。解析了枸杞中酚酸物質(zhì)在枸杞發(fā)酵前后的變化規(guī)律，為進一步探究酚酸降解產(chǎn)物對枸杞酒品質(zhì)的影響提供了基礎(chǔ)。