葛瑜

(長江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院,仙桃 433000)

先天性心臟病(congenital heart disease, CHD)是胎兒期心臟及大血管發(fā)育異常或形成障礙或出生后本應(yīng)關(guān)閉的通道未能閉合而引起的解剖結(jié)構(gòu)異常,是最常見的先天畸形[1]。我國每年約有15萬先天性心臟病患者出生,發(fā)生率居我國主要先天畸形的第3位,僅次于神經(jīng)管缺陷和唇腭裂,在嬰兒死亡原因中已占到第2-4位[2-3]。先天性心臟病患者大多心肌細(xì)胞發(fā)育不良,心肌細(xì)胞線粒體對氧的攝取和利用障礙,對心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI)尤其敏感,MIRI已成為影響先天性心臟病患者臨床療效的重要問題[4]。心肌缺血再灌注時期,心肌細(xì)胞會出現(xiàn)氧自由基增多、線粒體損傷、鈣超載、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬和凋亡等病理性修復(fù),導(dǎo)致心肌超微結(jié)構(gòu)進一步改變和不可逆性損傷,這一過程稱心肌缺血/再灌注損傷[5-7]。細(xì)胞自噬是真核生物細(xì)胞通過雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體將胞質(zhì)內(nèi)含物轉(zhuǎn)運到溶酶體,降解長壽蛋白及過量或有缺陷的細(xì)胞器的過程。細(xì)胞自噬具有雙面性[8-9],急性心肌缺血期細(xì)胞自噬可促進ATP產(chǎn)生,維持心肌能量供應(yīng)和心肌活力,而再灌注期心肌細(xì)胞過度自噬可引起自噬性凋亡導(dǎo)致心功能障礙。研究[10-11]表明,中醫(yī)療法具有促進血管新生、抗氧化等作用,有效保護心肌,降低MIRI程度。艾灸療法雖然在冠心病、心絞痛、急性心肌梗死、動脈硬化等成人心腦血管疾病方面的療效值得肯定[12-14],但在幼兒心臟疾病方面的研究較少。本實驗通過生化指標(biāo)檢測和缺血區(qū)心肌組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化,探討溫和灸預(yù)處理對MIRI幼鼠心肌的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

40只3～4 周齡健康SD大鼠(湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實驗動物中心,實驗動物設(shè)施使用證編號為No.00133292),雌雄不限,體質(zhì)量50～70 g,動物喂養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房。按照隨機數(shù)字表法將幼鼠分為假手術(shù)組、模型組、缺血預(yù)適應(yīng)組、溫和灸預(yù)處理組,每組10只。本實驗嚴(yán)格按照科技部[2006]398號《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》文件要求進行實驗。本實驗經(jīng)湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實驗動物中心倫理審查委員會審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號No.SXDX2019050A)。

1.2 主要儀器及試劑

ALC-V8S小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司),ECG-1106G六道自動分析心電圖機(深圳凱沃爾電子儀器有限公司)、蘄艾艾灸條(4 mm×120 mm,蘄春李時珍地道中藥材有限公司)、超聲細(xì)胞粉碎機(寧波新芝生物)、臺式高速冷凍離心機(Heal Force)、全自動研磨儀(武漢賽維爾生物)、酶標(biāo)檢測儀(BioTeK)、全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科技)、病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)、正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)、透射電子顯微鏡(FEI)、812包埋劑(SPI)、電鏡固定液(武漢谷歌生物)。

1.3 實驗方法

1.3.1 預(yù)處理方法

模型組、假手術(shù)組、缺血預(yù)適應(yīng)組取材前連續(xù)捆綁7 d,每日1次,每次20 min;溫和灸預(yù)處理組幼鼠仰臥固定于鼠板上,自制艾灸器距皮膚2～3 cm,溫和灸內(nèi)關(guān)、足三里、關(guān)元,參照《大鼠穴位圖譜的研制》[15],每日1次,每次20 min,連續(xù)治療7 d,每次治療時左、右足三里穴和內(nèi)關(guān)穴任選一側(cè),交替進行。

1.3.2 模型制備[16-17]

各組幼鼠預(yù)處理結(jié)束后第8天造模。

模型組:10%水合氯醛(0.25 ml/100 g)腹腔注射麻醉,起效后仰臥位捆綁于(37±3)℃的鼠臺上,接心電監(jiān)護儀,標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測心電圖,頸胸部去毛,切開頸部皮膚,于氣管軟骨環(huán)處行氣管切開術(shù),接入呼吸機。沿胸骨正中線左側(cè)第3、4肋間隙處橫向切開皮膚,鈍性分離各肌層及胸膜,挑開心包膜,暴露心臟,用2×6帶線無創(chuàng)縫合針在左心耳根部下方進針,深度為2～3 mm,繞過冠狀動脈左前降支在肺動脈圓錐旁出針,絲線上方墊一空心硅膠管,結(jié)扎冠狀動脈30 min后采用推管法再灌注120 min。

假手術(shù)組:麻醉、氣管插管、開胸、穿線方法同上,穿線后不結(jié)扎,150 min后取材。

缺血預(yù)適應(yīng)組:麻醉、氣管插管、開胸、穿線方法同上,打活結(jié)結(jié)扎冠狀動脈缺血5 min,松解扎線再灌注5 min,重復(fù)3次,后續(xù)缺血/再灌注操作同模型組。

溫和灸預(yù)處理組:造模方法模型組。

造模成功評價標(biāo)準(zhǔn)[18],①結(jié)扎左冠狀動脈前降支后,左心室前壁變青紫或蒼白,左心前室壁向外膨脹,搏動減弱。心電圖表現(xiàn)為ST段抬高(≥0.25 mV),R波增寬,即為心肌缺血標(biāo)志。②再灌注成功后,左心室前壁缺血區(qū)顏色恢復(fù)正常,同時出現(xiàn)反應(yīng)性充血水腫,抬高的ST段至少下降1/2左右。具體為心電圖顯示,結(jié)扎前幼鼠心電圖穩(wěn)定,缺血30 min及再灌注120 min過程中,Ⅱ?qū)?lián)ST段均顯著抬高,表現(xiàn)為明顯的缺血狀態(tài),與缺血時段相比,再灌注過程中幼鼠Ⅱ?qū)?lián)ST段回落且大于1/2,說明MIRI模型成功。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 標(biāo)本采集

造模結(jié)束后取材,心臟取血2 mL,3000 r/min離心10 min,分離血清,﹣20℃保存。模型組、缺血預(yù)適應(yīng)組、溫和灸預(yù)處理組幼鼠均取結(jié)扎下段缺血區(qū)心肌組織,假手術(shù)組取穿線下段組織,0.9%氯化鈉清洗,再將各組組織修剪成3份1 mm3的組織塊,1份投入電鏡固定液中4℃固定2～4 h;1份投入4%多聚甲醛中固定24 h以上;1份裝入EP管后凍存于﹣80℃冰箱。

1.4.2 生化指標(biāo)檢測

紫外分光光度法檢測血清CK-MB、cTnT,上樣后全自動生化分析儀器自動檢測,考馬斯亮藍法測定ATP、SOD,嚴(yán)格按試劑盒說明書操作測出CK-MB、cTnT、ATP含量及SOD活性。

1.4.3 石蠟切片HE染色實驗

將組織從固定液中取出,梯度乙醇脫水后浸蠟組織包埋。凍臺冷卻,凝固后修整蠟塊,片厚4 μm。組織展平后撈起,放進60℃烘箱內(nèi)將蠟烤化備用。依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min-二甲苯Ⅱ 20 min-無水乙醇Ⅰ 10 min-無水乙醇Ⅱ 10 min-95%乙醇5 min-90%乙醇5 min-80%乙醇5 min-70%乙醇5 min-蒸餾水洗。切片入Harris蘇木素染3～8 min,自來水沖洗,1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒,沖洗,0.6%氨水返藍,沖洗。切片入伊紅染液中染色1～3 min。依次放入95%乙醇Ⅰ 5 min-95%乙醇Ⅱ 5 min-無水乙醇Ⅰ 5 min-無水乙醇Ⅱ 5 min-二甲苯Ⅰ 5 min-二甲苯Ⅱ 5 min中脫水透明,稍晾干,中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。

1.4.4 透射電鏡觀察

細(xì)胞離心后棄去培養(yǎng)液,加入電鏡固定液4℃固定2 h。0.1 M磷酸緩沖液PBS(pH7.4)漂洗3次,每次15 min。組織依次入50%-70%-80%-90%-95%-100%乙醇脫水,每次15 min。丙酮:812包埋劑=1:1混合液滲透過夜,純812包埋劑滲透過夜。60℃聚合48 h。切片。鈾鉛雙染色,切片室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察,采集圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用IBM-SPSS22.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用ANOVA分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清CK-MB、cTnT、ATP濃度及SOD活性比較

由表1可見,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清CKMB、cTnT濃度均顯著上升(P＜0.05),ATP濃度和SOD活性均顯著下降(P＜0.05);與模型組比較,缺血預(yù)適應(yīng)組和溫和灸預(yù)處理組大鼠血清CK-MB、cTnT濃度均顯著降低(P＜0.05),ATP濃度和SOD活性均顯著增加(P＜0.05),其中,溫和灸預(yù)處理組和缺血預(yù)適應(yīng)組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組血清CK-MB、cTnT、ATP濃度及SOD活性比較 (±s)

表1 各組血清CK-MB、cTnT、ATP濃度及SOD活性比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n CK-MB(U/mL) cTnT(μg/L) ATP(μmoL/Kg) SOD(U/mg pro)假手術(shù)組 10 1.10±0.47 1.32±0.29 5.91±0.36 146.00±9.80模型組 10 2.31±0.491) 8.80±2.431) 2.01±0.341) 70.10±8.501)缺血預(yù)適應(yīng)組 10 1.40±0.401)2) 5.20±1.831)2) 4.16±0.571)2) 99.10±6.101)2)溫和灸預(yù)處理組 10 1.38±0.421)2) 5.19±1.911)2) 3.99±0.511)2) 101.25±5.301)2)

2.2 HE染色實驗觀察各組幼鼠心肌細(xì)胞病理變化

由圖1可見,假手術(shù)組幼鼠心肌纖維排列基本規(guī)則,未見明顯溶解斷裂及壞死,細(xì)胞間隙正常;模型組心肌纖維排列紊亂,可見明顯溶解斷裂甚至壞死,組織水腫,間隙增大,部分細(xì)胞核及線粒體固縮,部分線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整;缺血預(yù)適應(yīng)組和溫和灸預(yù)處理組心肌纖維排列紊亂程度、心肌細(xì)胞水腫程度及間質(zhì)水腫程度較模型組均有所改善,壞死灶減輕,心肌纖維間隙輕度增寬,細(xì)胞核及線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,其中溫和灸預(yù)處理組改善較明顯。

圖1 心肌組織HE染色切片的病理學(xué)檢查(×200)

2.3 透射電鏡觀察各組幼鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

由圖2可見,假手術(shù)組幼鼠心肌細(xì)胞排列基本規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整,橫紋清晰,胞質(zhì)充實;線粒體數(shù)量正常,結(jié)構(gòu)清晰完整,可見少量自噬空泡。模型組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊,肌纖維溶解斷裂甚至壞死,橫紋模糊不清,間隙增大;線粒體腫脹明顯甚至破裂,線粒體嵴斷裂、缺失;可見多個自噬空泡、自噬溶酶體。與模型組相比,缺血預(yù)適應(yīng)組和溫和灸預(yù)處理組心肌纖維較清晰,細(xì)胞排列稍紊亂,間隙輕度增寬;線粒體結(jié)構(gòu)基本完整,線粒體嵴未見明顯斷裂、缺失;細(xì)胞內(nèi)自噬空泡和自噬溶酶體較少,其中,溫和灸預(yù)處理組較缺血預(yù)適應(yīng)組改善更明顯。

圖2 透射電鏡觀察心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化

4 討論

先天性心臟病患者心肌細(xì)胞線粒體對氧的攝取和利用障礙,對心肌缺血再灌注損傷尤其敏感,在進行外科手術(shù)和介入治療過程中心肌處于缺血缺氧狀態(tài),MIRI嚴(yán)重影響先心病患者臨床療效[19]。嬰幼兒心肌細(xì)胞尚未成熟,結(jié)構(gòu)、功能、缺血、缺氧等方面與成人心肌存在明顯差異,因此成人心臟手術(shù)中心肌保護技術(shù)并不適用于嬰幼兒[20-21]。大量研究[22-24]證實,內(nèi)關(guān)、足三里、關(guān)元在治療急慢性心肌缺血、冠心病、血管粥樣硬化等心血管疾病方面療效顯著,能夠提高機體免疫力、提高線粒體抗氧化能力,降低心肌酶活性,減輕MIRI。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞的一種自我保護機制,細(xì)胞利用自噬溶酶體降解受損、變性或衰老的大分子物質(zhì)及細(xì)胞器,平衡自身代謝,在調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和死亡的過程中起著重要的作用[25]。正常心臟中維持心肌功能的自噬活性水平較低,在心肌梗死、MIRI等心臟應(yīng)激期間自噬較活躍[26]。目前研究普遍認(rèn)為,自噬是MIRI的重要機制之一,在心肌缺血/再灌注過程中起著雙重作用,缺血期通過緩解能量危機和降解受損細(xì)胞器保護心肌,再灌注期過度的自噬激活會引起細(xì)胞自噬性凋亡,因此許多學(xué)者認(rèn)為通過調(diào)控細(xì)胞自噬可減輕MIRI[27-28]。自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致MIRI的又一重要致病機制,氧自由基的主要清除酶是超氧化物歧化酶(SOD),早期抗氧化治療能明顯減輕MIRI[29]?！叭毖A(yù)適應(yīng)”是Murry CE等[30]提出的一種內(nèi)源性心臟保護機制,是指在梗死性缺血發(fā)生之前反復(fù)實施數(shù)次規(guī)律、短暫的非損傷性缺血/再灌注的過程,后期實驗證明,心肌缺血預(yù)適應(yīng)可以調(diào)控自噬,增強心肌細(xì)胞自噬活性,使心肌處于應(yīng)激狀態(tài),增強心臟對后期嚴(yán)重缺血缺氧的抵抗力與耐受力,減少最終心肌梗死范圍,從而達到保護心肌的作用[31-32]。本實驗中,溫和灸預(yù)處理能明顯提高SOD活性,降低心肌ATP消耗速度,與模型組相比,溫和灸預(yù)處理組和缺血預(yù)適應(yīng)組自噬空泡和自噬溶酶體較少,初步說明溫和灸預(yù)處理能維持心肌能量供應(yīng),增強心肌抗氧化能力,能產(chǎn)生與缺血預(yù)適應(yīng)相似的調(diào)控細(xì)胞自噬,減輕細(xì)胞過度自噬造成的損傷,保護心臟。總的來說,本實驗結(jié)果表明,溫和灸預(yù)處理能增強心肌抗氧化能力,維持心肌細(xì)胞能量供應(yīng),減輕MIRI對心肌超微結(jié)構(gòu)造成的傷害,其作用機制可能與調(diào)控細(xì)胞自噬相關(guān)。此外,與心肌缺血預(yù)適應(yīng)干預(yù)相比,艾灸預(yù)處理操作方便,避免了剖開胸腔時造成的損傷,具有較大的臨床應(yīng)用價值。但由于本次實驗樣本量較小,缺少對自噬相關(guān)基因的研究,因此仍需后期大樣本、全方位、分子生物學(xué)方面的實驗進一步證實。