翁志軍,汪迪,鄭寒丹,施茵,劉雅楠,包春輝,陸嫄,吳煥淦,劉慧榮,馬曉芃,吳璐一,黃艷

(1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸免疫效應(yīng)重點(diǎn)研究室,上海 200030)

克羅恩病(Crohn’s Disease, CD)是一種涉及胃腸道全層的慢性非特異性肉芽腫性炎癥性腸病。目前,該病病因尚不明確,與遺傳易感性、免疫、腸道菌群失調(diào)、環(huán)境、精神等多方面因素有關(guān)[1]。歐美地區(qū)發(fā)病率較高,亞洲發(fā)病率較低。有研究顯示,CD在英國發(fā)病率為 10.1/105人～11.1/105人,患病率為 55/105人～140/105人,每年大約有13 300例新發(fā)病例[2]。我國CD總體發(fā)病率及患病率分別為 0.848/105人和 2.29/105人[3],雖總體低于歐美國家,但呈上升趨勢(shì),已成為消化系統(tǒng)常見的難治性疾病之一。臨床常用5-氨基水楊酸、激素、免疫抑制劑、生物制劑等為主進(jìn)行治療,可較好地控制急性癥狀,誘導(dǎo)緩解;但撤藥時(shí)疾病容易反復(fù)發(fā)作或藥物的不良反應(yīng)使臨床應(yīng)用受限[4]。

針灸在治療炎癥性腸病上有不同程度的療效[5-6]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn),隔藥灸治療 CD療效確切,不僅可以改善輕度、中度CD患者的臨床癥狀(近期有效率為72.5%),還能降低活動(dòng)期CD患者的克羅恩病疾病活動(dòng)指數(shù)(CDAI),改善結(jié)腸組織炎癥,提高患者的生活質(zhì)量[7-8]。相關(guān)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)針灸能通過上調(diào) CD患者結(jié)腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá),修復(fù)腸上皮屏障病變,減輕腸道炎癥反應(yīng)[9]。但針灸治療 CD的作用機(jī)制尚未闡明。

基因表達(dá)譜的改變和功能異常在免疫功能調(diào)節(jié)和自身免疫性疾病(包括CD)的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[10]。單細(xì)胞測(cè)序(single-cell RNA-seq)技術(shù)的成熟開展,能從外周血、結(jié)腸中分離的稀有細(xì)胞的層面研究 CD的發(fā)病機(jī)制,目前單細(xì)胞測(cè)序研究較多的是轉(zhuǎn)錄組學(xué)[11-12]。LncRNA/miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的分子機(jī)制成為 CD發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)[13-14],而 messenger RNA(mRNA)作為蛋白翻譯調(diào)控的重要 RNA,實(shí)現(xiàn)了遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá),能直接影響蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞表型。已有研究證實(shí)CD患者結(jié)腸炎癥部位的黏膜組織中有多種與CD相關(guān)的mRNA表達(dá)的異常[15],本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)艾灸能調(diào)控 CD大鼠結(jié)腸黏膜免疫和自噬相關(guān)基因的表達(dá)異常[16]。因此,本研究進(jìn)一步采用基因芯片技術(shù)對(duì)CD進(jìn)行全面的mRNA表達(dá)譜的研究,篩選出針灸治療CD患者結(jié)腸黏膜的差異表達(dá)的基因,再對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析和Pathway生物信息學(xué)分析,探索針灸治療 CD的相關(guān)信號(hào)通路,以期為針灸治療CD效應(yīng)機(jī)制研究提供新的研究方向,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

本研究的3名CD受試者來源于本課題組上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所的 1項(xiàng)克羅恩病的臨床試驗(yàn);并在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)鏡中心招募健康受試者3名作為對(duì)照。該試驗(yàn)已通過上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合CD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[17];②經(jīng)確診的輕度、中度CD患者(CDAI為151～450分);③前3個(gè)月未服用與本病治療相關(guān)的藥物;④同意參加本試驗(yàn)并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 CD排除標(biāo)準(zhǔn)

①重度CD患者或緩解期患者(CDAI＞450分或＜150分);②妊娠或哺乳期患者;③伴有心、腦、肝、腎及造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病的患者;④精神病或其他嚴(yán)重疾病患者。

1.3.2 健康受試者排除標(biāo)準(zhǔn)

腸鏡下肉眼觀察有結(jié)腸炎癥、腫瘤者。

1.4 剔除脫落標(biāo)準(zhǔn)

①誤診、誤納的患者;②依從性差或有嚴(yán)重不良反應(yīng)者;③治療期間病情惡化必須實(shí)施緊急措施者;④主動(dòng)退出或失訪者;⑤未能完成全部治療及隨訪者。

2 治療方法

CD患者采用隔藥灸配合針刺治療。

2.1 隔藥灸治療

取穴分2組,①天樞(雙)、氣海、水分穴;②雙側(cè)腎俞、大腸俞穴,兩組穴位交替使用。穴位定位參照《經(jīng)穴部位(GB1234690)》標(biāo)準(zhǔn)。將附子、肉桂、丹參、紅花等中藥研末成粉,用黃酒調(diào)和藥粉成厚糊狀,并用模具制成直徑2.3 cm、厚約0.5 cm的藥餅。常規(guī)消毒后,將藥餅放在相關(guān)穴位皮膚上,再將高1.7 cm、重約1.8 g的艾炷(河南南陽臥龍漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司)置于藥餅上,點(diǎn)燃艾炷后施灸,治療30 min。每日1次,每周6次,12次為1個(gè)療程,療程間休息3 d,共治療6個(gè)療程。

2.2 針刺治療

取穴分兩組,①足三里、上巨虛、曲池、合谷穴;②T6-L1夾脊穴,兩組穴位交替使用。局部常規(guī)消毒后,采用 0.30 mm×40 mm毫針直刺20～40 mm,得氣后行平補(bǔ)平瀉法,留針30 min。隔日1次,每周3次,兩周為1個(gè)療程,療程間休息3 d,共治療6個(gè)療程。

3 治療效果

3.1 觀察指標(biāo)

3.1.1 結(jié)腸黏膜組織

所有健康志愿者及 CD患者在治療前后分別進(jìn)行結(jié)腸鏡檢并采集結(jié)腸黏膜,通過結(jié)腸鏡檢查確定無任何胃腸道疾病,取距結(jié)腸息肉旁5 cm處取肉眼正常的結(jié)腸黏膜。標(biāo)本離體后分裝于10%甲醛固定和凍存管,凍存管立即內(nèi)置于液氮中,隨后保存于﹣80℃冰箱。

3.1.2 組織病理學(xué)觀察

將 10%甲醛溶液固定的結(jié)腸黏膜組織脫水包埋,每片切成 4 μm厚制成玻片,先脫蠟,再脫水。采用蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)改變。

3.1.3 mRNA芯片檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

采用Trizol方法提取總RNA,參照廠家提供的實(shí)驗(yàn)方法(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行 RNA質(zhì)檢,Nanodrop(ND-1000,Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA)檢測(cè)其質(zhì)量和定量;采用 1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察總 RNA完整性,安捷倫 2100(Agilent Technologies)進(jìn)行樣本的質(zhì)控,RNA integrity number(RIN)值＞7的 RNA樣本用于芯片分析。RNA樣本保存在﹣80℃冰箱備用。芯片微陣列于Affymetrix fluidics station 450中洗滌后,先用鏈霉親和素/藻紅蛋白染色。對(duì)每個(gè)樣本,用生物素化的山羊抗鏈霉親和素孵育后,再用鏈霉親和素/藻紅蛋白進(jìn)行二次孵育以進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度,然后測(cè)量第二輪強(qiáng)度。使用由Affymetrix Microarray Suite軟件控制的Affymetrix掃描儀掃描微陣列。

基因芯片檢測(cè)后,使用GenePix 4000B芯片掃描芯片的熒光強(qiáng)度,并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存,對(duì)Raw data和Clean data進(jìn)行深度評(píng)估,mapping到基因組上,mapping reads數(shù)超過總reads數(shù)的90%,對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,得到基因的表達(dá)量。設(shè)定基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)為其相對(duì)表達(dá)量 Log2fold change(FC)≥|±1|,對(duì)差異基因進(jìn)行篩選、聚類分析、基因本體(Gene Ontology, GO)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Pathway)富集分析研究。

3.2 結(jié)果

3.2.1 CD患者治療后結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)比較(見表1)

表1 CD患者治療后結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)比較

3.2.2 針灸治療CD結(jié)腸黏膜差異表達(dá)基因及聚類分析

運(yùn)用基因芯片檢測(cè)健康志愿者及 CD患者治療前后結(jié)腸黏膜組織的基因表達(dá)譜。芯片結(jié)果用Limma進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(Linear Models and Empirical Bayes Methods for Assessing Differential Expression in Microarray Experiments),在36333個(gè)探針(NimbleGen HG 18.0)中,健康志愿者和CD患者治療前共有3449個(gè)基因存在顯著性差異,其中CD患者治療前較健康志愿者上調(diào)2250個(gè),下調(diào)1199個(gè);CD患者治療后與治療前有顯著性差異的基因有1926個(gè),其中治療后較治療前上調(diào)536個(gè),下調(diào)1390個(gè)(P＜0.05,FDR＜0.05)。

為了進(jìn)一步研究各組基因表達(dá)的不同,本研究采用Venn Diagrams分析差異基因的交集。將CD患者治療前與健康志愿者差異表達(dá)的3449個(gè)mRNA和CD患者治療后與治療前差異表達(dá)的1926個(gè)mRNA取交集,發(fā)現(xiàn)共有388個(gè)交集基因。其中,治療后下調(diào)的差異基因與治療前相對(duì)于健康志愿者上調(diào)的表達(dá)基因共有326個(gè);而治療后上調(diào)的差異表達(dá)基因與治療前相對(duì)于健康人下調(diào)的共表達(dá)基因有62個(gè)(見圖1A-B)。說明針灸更趨于抑制過高表達(dá)的基因。

圖1 組間差異表達(dá)基因的Venn diagrams及熱圖和聚類分析

采用Cluster 3.0和Treeview軟件對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。將3組交集的388個(gè)基因的表達(dá)量均取10為底的對(duì)數(shù)處理,熱圖體現(xiàn)了CD病理狀態(tài)下上調(diào)和下調(diào)的基因在各個(gè)樣本中的表達(dá),同時(shí)體現(xiàn)了針灸后這些病理改變的差異表達(dá)基因可以被逆轉(zhuǎn)(見圖1C)。聚類圖體現(xiàn)健康志愿者與CD患者治療后基因表達(dá)類似,而與CD患者治療前基因表達(dá)不同(見圖1D)。

3.2.3 差異表達(dá)基因篩選

由于針灸治療可調(diào)控的 CD患者治療前較健康志愿者的差異表達(dá)基因較多,本研究分別將針灸后逆轉(zhuǎn)CD病理性基因中上調(diào)的62個(gè)基因和下調(diào)的326個(gè)基因,按照 log2(FC)大小排列,前 30個(gè)差異表達(dá)基因列表見表2。其中,在 CD患者治療前表達(dá)上調(diào),且在 CD患者治療后下調(diào)的倍數(shù)均＞3的基因有4個(gè),即CPS1、SCIN、C12orf27和GJB1。而在CD患者治療前表達(dá)下調(diào)2倍以上,能被針灸逆轉(zhuǎn)的基因倍數(shù)＞2的基因只有CKB。詳見表2、表3。

表2 針灸逆轉(zhuǎn)的CD中前30個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因

表3 針灸逆轉(zhuǎn)的CD中前30個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因

3.2.4 差異表達(dá)基因的 Gene Ontology(GO)和Pathway功能分析

本研究對(duì)針灸后相對(duì)于 CD患者的結(jié)腸差異基因進(jìn)行顯著性GO和Pathway分析。按照生物途徑,分子功能和細(xì)胞定位對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類,通過對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO terms富集度統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析,其前30個(gè)GO功能富集主要體現(xiàn)了針灸對(duì)CD患者免疫系統(tǒng)、神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控3個(gè)方面的調(diào)節(jié),主要包括轉(zhuǎn)錄因子STAT磷酸化、ATP酶活性、B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、自然殺傷細(xì)胞相關(guān)免疫等(見圖2)。通過將差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG Pathway富集分析,尋找顯著性差異變化的生物學(xué)調(diào)控通路,其富集較多的前30個(gè)通路主要體現(xiàn)在針灸對(duì)CD患者免疫系統(tǒng)、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩方面信號(hào)通路的調(diào)節(jié),主要包括 Toll-like受體信號(hào)通路、自噬調(diào)節(jié)系統(tǒng)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(見圖3)。

圖2 CD患者治療后差異表達(dá)基因前30個(gè)GO分析

圖3 CD患者治療后差異表達(dá)基因前30個(gè)Pathway功能分析

4 討論

克羅恩病是一種自身免疫性炎癥性腸病,其關(guān)鍵作用因素尚未完全明確?；跀?shù)據(jù)庫的基因表達(dá)譜研究和蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)已部分揭示了與CD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18]。目前,全基因組關(guān)聯(lián)性研究已經(jīng)確定了170多個(gè)與CD相關(guān)的基因位點(diǎn),對(duì)CD相關(guān)基因的整合和網(wǎng)絡(luò)分析將有助于充分明確疾病的預(yù)測(cè)基因以及了解CD的發(fā)病機(jī)制[19-20]。研究表明 CD患者結(jié)腸中有多種與炎癥相關(guān)基因的表達(dá)失調(diào),如 C4BPB、IL1RN、CXCL1、CXCL11、MMP7、SOD2等[21]。因此,檢測(cè)和比較健康志愿者及CD患者針灸治療前后結(jié)腸中的基因差異,也有利于發(fā)現(xiàn)針灸可調(diào)控基因的潛在功能,從而更好地闡釋針灸的免疫效應(yīng)機(jī)制。本研究運(yùn)用基因芯片技術(shù),發(fā)現(xiàn)CD患者治療前與健康志愿者結(jié)腸黏膜有上千個(gè)差異表達(dá)的 mRNAs,而針灸可調(diào)控CD中388個(gè)mRNA的表達(dá)。有研究通過數(shù)據(jù)庫分析鑒定出927個(gè)與CD相關(guān)的差異表達(dá)基因,其中PPAR信號(hào)通路中的LDLR、TLR2、FOXM1、NPY、LPL被認(rèn)為是參與CD發(fā)病機(jī)制的重要基因[18]。Hong SN等[22]運(yùn)用 RNA-seq研究了正常黏膜,非炎癥和炎癥部位的CD黏膜之間的全基因組轉(zhuǎn)錄組差異,在950個(gè)差異表達(dá)基因中,CD炎癥部位黏膜組織中 ANGPT2、CHN1、CPXM1、CPZ、CXCL1、FCN3、GJC1、HSD11B1、LZTS1、MEOX1、MMP12、PLA1A、SERPINE1、SGIP1和TRPC4等16個(gè)基因顯著上調(diào),而 FAM189、PDE6A、SLC38A4和HMGCS2基因顯著下調(diào)。多重基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD患者結(jié)腸炎癥部位的黏膜組織中炎癥因子 IL17A、IL17F、IL23R、CCR6及IFN-γ的基因,編碼抗菌肽的DEFB4和HAMP基因以及REG1A、LCN2、NOS2、CXCL1-2和S100A9基因等均明顯上調(diào)[23-24]。還有研究通過定量基因表達(dá)分析了與CD相關(guān)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因,在CD病情惡化時(shí),STAT1和PSKH1的特定表達(dá)上調(diào),ABCB1和FASL表達(dá)下調(diào),而在活動(dòng)期患者中, FASR和NFKB1基因表達(dá)上調(diào)明顯[25]。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn),本研究所得到的CD差異表達(dá)基因與以往的研究有很大不同,這可能是與檢測(cè)分析方法、樣本量的多少等因素有關(guān)。本研究可能獲得了許多新的與CD相關(guān)的基因靶點(diǎn),這將為CD的機(jī)制研究提供新的思路。

針灸在治療CD上具有明顯的優(yōu)勢(shì)[8-9],以往研究證實(shí)針灸能通過上調(diào)A20表達(dá)水平,抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑,緩解 CD腸上皮細(xì)胞凋亡的增加[26],并能調(diào)節(jié) TNF-α-NF-κB-MLCK通路的異常激活,修復(fù) CD腸上皮黏膜屏障[27]。本研究發(fā)現(xiàn)針灸可以逆轉(zhuǎn)CD患者結(jié)腸中多種差異表達(dá)的基因,筆者重點(diǎn)關(guān)注了上下調(diào)較顯著的前30個(gè)基因。目前這些基因與CD關(guān)系的研究較少,也尚未有針灸調(diào)控CD中這些基因表達(dá)的報(bào)道。但是,其中的 GSTA1是一種谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-α,大腸桿菌脂多糖刺激可以通過GSTA1加重CD結(jié)腸黏膜炎癥[28],而 TCN2基因多態(tài)性也被證實(shí)是 CD的易感基因[29]。筆者的基因芯片的結(jié)果顯示針灸可以下調(diào) CD中GSTA1和TCN2基因的高表達(dá)。因此,針灸可能通過調(diào)控GSTA1和TCN2的表達(dá)起到緩解CD結(jié)腸黏膜炎癥的作用。但是GSTA1和TCN2具體的作用以及其他顯著差異表達(dá)基因是否在針灸治療 CD中發(fā)揮了作用還有待深入研究和證實(shí)。

研究證實(shí)多種免疫炎癥因子和免疫信號(hào)通路參與CD的發(fā)生發(fā)展,如Treg/Th17相關(guān)因子、IL-12/IL-23通路、JAK-STAT信號(hào)通路、TLR4-NF-κB信號(hào)等[30-34],自噬相關(guān)基因?qū)D的生理病理也有很大的影響[35]。CD結(jié)腸黏膜中的差異表達(dá)基因在通路水平的分析顯示,CD中的病毒感染和自身免疫通路明顯上調(diào)[36]。筆者也分析了針灸調(diào)控的差異顯著的前 30個(gè)上調(diào)和下調(diào)mRNA涉及的通路,發(fā)現(xiàn)主要有轉(zhuǎn)錄因子STAT磷酸化、ATP酶活性、B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、自然殺傷細(xì)胞相關(guān)免疫等與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的生物功能,并參與了 Tolllike受體信號(hào)通路、自噬調(diào)節(jié)系統(tǒng)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等與免疫炎癥相關(guān)的信號(hào)通路,這與以往研究中與 CD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路具有一致性。因此,針灸可能通過調(diào)控關(guān)鍵mRNA的表達(dá),影響其生物功能和與疾病相關(guān)的多種因子和免疫信號(hào)通路,從而起到改善和緩解CD腸道免疫炎癥的作用。

綜上所述,CD患者結(jié)腸黏膜組織存在基因表達(dá)譜的改變,針灸治療可以調(diào)節(jié)部分疾病狀態(tài)下差異表達(dá)的基因,其參與和涉及了多種與免疫炎癥相關(guān)的生物功能和信號(hào)通路,提示針灸能有效治療CD的機(jī)制與影響了結(jié)腸黏膜中的基因表達(dá)譜相關(guān),主要參與細(xì)胞周期、免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬和組織重建等生物學(xué)過程,相關(guān)的通路主要有Toll-like受體信號(hào)通路、自噬調(diào)節(jié)系統(tǒng)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。該研究結(jié)果為后期研究提供了方向,如細(xì)胞自噬的作用、免疫調(diào)節(jié)的Toll-like受體信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等。后期可結(jié)合多組學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)研究,將轉(zhuǎn)錄組學(xué)與DNA甲基化、非編碼RNA介導(dǎo)的mRNA沉默、腸道菌群、組蛋白修飾、宏基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)等高通量測(cè)序結(jié)果結(jié)合分析,有助于探索新的作用機(jī)制。