張?jiān)孪?陳 亨,沈云峰

0 引言

骨髓微環(huán)境為低氧狀態(tài),低氧是影響造血干細(xì)胞和白血病細(xì)胞生物學(xué)的關(guān)鍵微環(huán)境因素。1992年Wang等[1]在研究缺氧誘導(dǎo)的紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)的基因表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種蛋白質(zhì),能與EPO基因3′端增強(qiáng)子的寡核苷酸序列特異性結(jié)合,并促進(jìn)EPO的轉(zhuǎn)錄,首次將這種蛋白質(zhì)命名為缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)。

HIF-1主要由HIF-1α和HIF-1β 2個(gè)亞基組成。HIF-1α是唯一的氧氣調(diào)節(jié)亞單位,可通過(guò)刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖酵解酶和糖酵解誘導(dǎo)因子的表達(dá),調(diào)節(jié)從氧化應(yīng)激反應(yīng)到糖酵解的代謝[2]。HIF-1α在正常組織和癌細(xì)胞中都是缺氧反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,低氧時(shí)可與HIF-1β結(jié)合,調(diào)控多種低氧反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。HIF-1α在肝癌、肺癌、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤、卵巢癌、腎細(xì)胞癌等多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá),并調(diào)節(jié)其生物學(xué)行為,包括新生血管生成、腫瘤細(xì)胞的新陳代謝、腫瘤干細(xì)胞的免疫逃逸等。而在白血病微環(huán)境中,各種異常均表明存在HIF-1反應(yīng),如VEGF、CXCL12、SCF的分泌增加,以及缺氧程度和酸度的增加。Bonnet、Rouault-Pierre等[3-4]研究證實(shí),急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者的骨髓在白血病晚期階段高度缺氧,且所有患者確診時(shí)均有HIF-1α過(guò)表達(dá),當(dāng)達(dá)到細(xì)胞遺傳學(xué)緩解時(shí),HIF-1α染色陽(yáng)性率顯著降低。此外,Wang等[5]為了探討HIF-1α和VEGF-A基因在AML中的作用,收集了57例AML患者和17例正常人外周血和骨髓標(biāo)本,結(jié)果顯示,急性髓系白血病(AML)患者HIF-1α和VEGF-A的表達(dá)均高于正常對(duì)照組,且HIF-1α與VEGF-A呈正相關(guān),認(rèn)為這與白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān),可能成為一個(gè)很有前途的治療靶點(diǎn)。Kontos等[6]發(fā)現(xiàn),HIF-1α mRNA高表達(dá)的慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)患者的總體生存率較低,其表達(dá)狀態(tài)指導(dǎo)預(yù)后的意義可獨(dú)立于臨床分期和其他預(yù)后指標(biāo),因此,HIF-1α過(guò)表達(dá)可作為CLL預(yù)后不良的獨(dú)立分子標(biāo)志物。Abdul-Aziz等[7]發(fā)現(xiàn),缺氧可導(dǎo)致骨髓中AML細(xì)胞的轉(zhuǎn)移抑制因子(Migration inhibitory factor,MIF)高表達(dá),且表達(dá)水平高于外周血或脾臟。結(jié)果表明,在缺氧條件下,沉默HIF-1α可抑制MIF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,從而提高AML模型的存活率,表明缺氧/HIF-1α/MIF軸在促進(jìn)AML腫瘤存活和增殖方面的重要作用。

近期研究表明,HIF-1通路的激活在白血病的進(jìn)展、治療和預(yù)后中發(fā)揮著重要作用。因此,抑制HIF-1α的表達(dá)成為延緩疾病進(jìn)展、治療白血病的新思路。目前,針對(duì)HIF-1α抑制劑的研究,多集中于實(shí)體瘤領(lǐng)域,而白血病方面較為少見(jiàn)。本文總結(jié)了近年來(lái)在白血病領(lǐng)域研究較多的幾種HIF-1α抑制劑及其在白血病中的研究進(jìn)展。

1 HIF-1的功能結(jié)構(gòu)及基因調(diào)控

1.1 HIF-1的結(jié)構(gòu) HIF-1以異源二聚體的形式存在,主要由HIF-1α和HIF-1β 2個(gè)亞基組成。HIF-1α為HIF-1特有,是活性亞基,決定了HIF-1的穩(wěn)定性和活性;HIF-1β是組成性亞基,又稱為芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)。HIF-1α和HIF-1β亞基均為bHLH/PAS家族的成員,包含bHLH結(jié)構(gòu)域(Basic helix-loop-helix,bHLH)、PAS結(jié)構(gòu)域(Per-ARNT-Sim,PAS)、反式轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Transcriptional activation domain,TAD)、氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(Oxygen-dependent degradation domain,ODD區(qū))等結(jié)構(gòu)。

1.2 HIF-1的降解和穩(wěn)定性 常氧條件下,在細(xì)胞漿內(nèi),氧感受器輔氨酰羥化酶(Prolyl hydroxylases,PHDs)羥化HIF-1α亞基ODD區(qū)輔氨酸,使HIF-1α與VHL蛋白(Von hippel-lindau protein,pVHL)結(jié)合形成復(fù)合物。pVHL是泛素連接酶的成分之一,可引導(dǎo)HIF-1α進(jìn)入泛素-蛋白酶體途徑降解。而在缺氧條件下,由于氧分子減少,PHDs的作用受到抑制,阻止了HIF-1α的泛素降解途徑,導(dǎo)致HIF-1α降解速度減慢,引起HIF-1α在細(xì)胞核內(nèi)積聚并轉(zhuǎn)錄激活。HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程相對(duì)復(fù)雜,此過(guò)程的調(diào)控因子包括:P300/CBP、CITED2、MAPK、HSP90、SRC家族等,這些因子相互作用,協(xié)同調(diào)節(jié)HIF-1。

1.3 HIF-1對(duì)下游靶基因的調(diào)控 HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活以后在細(xì)胞核內(nèi)聚集,并與核內(nèi)的HIF-1β結(jié)合形成有活性的HIF-1復(fù)合物,與其調(diào)節(jié)的下游靶基因的缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia response element,HRE)結(jié)合,形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。HRE是HIF-1靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子內(nèi)所共有的一段基因序列,又稱反式作用DNA序列,為HIF-1α的DNA結(jié)合位點(diǎn)。目前,已有超過(guò)70個(gè)基因被HIF-1調(diào)控,這些下游靶基因被激活后,可促進(jìn)腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖,保證腫瘤的能量代謝,最終加速腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥性的出現(xiàn)。

2 HIF-1α抑制劑

2.1 棘霉素 棘霉素(Echinomycin)是喹噁啉家族的一員,通過(guò)2個(gè)扁平狀的喹喔啉環(huán)插入到DNA分子的堿基對(duì)之間,從而抑制了DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和RNA合成[8]。臨床前研究證實(shí),棘霉素在肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、惡性肉瘤等疾病中具有抗腫瘤活性。棘霉素的靶序列包括缺氧反應(yīng)元件序列,從而使棘霉素成為有效的HIF-1α抑制劑。

2.2 BAY 87-2243 BAY 87-2243是選擇性HIF-1α抑制劑,主要是通過(guò)抑制線粒體復(fù)合體I來(lái)抑制線粒體活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,進(jìn)而降低HIF-1活性。BAY 87-2243的活性依賴于PHDs和VHL蛋白,因此，PHDs-VHL-蛋白酶體軸在HIF-1α蛋白降解中具有重要作用。

2.3 EZN-2208 伊立替康是拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑,SN-38是伊立替康的活性代謝物,其溶解性差,不適合作為治療劑,研究者將聚乙二醇附著在SN-38上開(kāi)發(fā)出了EZN-2208。與伊立替康相比,EZN-2208的半衰期更長(zhǎng),溶解性更好,藥代動(dòng)力學(xué)更優(yōu),不良反應(yīng)更少[9]。目前,EZN-2208在晚期成人實(shí)體瘤、兒童復(fù)發(fā)性或難治性實(shí)體腫瘤中具有臨床耐受性,主要的不良反應(yīng)包括腹瀉、脫水、骨髓抑制、發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少、惡心和疲勞等[10-11]。EZN-2208還可誘導(dǎo)下調(diào)腫瘤中的HIF-1α及其下游靶基因(如MMP2、VEGF、GLUT1、GLUT3等)的mRNA水平,具有更強(qiáng)的抗增殖、抗凋亡和抗血管生成作用。

2.4 吖啶黃素 吖啶黃素(Acriflavine,ACF)是一種FDA批準(zhǔn)的具有HIF-1α抑制特性的小分子天然化合物,可抑制上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,激活p53導(dǎo)致細(xì)胞死亡,并誘導(dǎo)線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡和自噬。ACF可抑制乳腺癌、骨肉瘤、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和腦腫瘤等多種腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展。臨床研究顯示,長(zhǎng)期服用ACF作為抗腫瘤藥物，未發(fā)現(xiàn)重大不良反應(yīng)[12-14]。

2.5 雷公藤甲素 雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是從雷公藤中提取的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物,具有抗炎及免疫抑制作用,主要用于自身免疫性疾病,如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎等。TPL可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),包括急性髓系白血病、乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和多種消化道腫瘤(如結(jié)腸癌、肝癌、胃癌和胰腺癌)等。

2.6 2-甲氧基雌二醇 2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME2)是一種天然存在的雌激素代謝物,作為一種抗癌劑已被廣泛研究,在體內(nèi)外對(duì)尤文肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、食管癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌等腫瘤均有抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用。2-ME2也具有抗白血病活性,其主要靶點(diǎn)為缺氧誘導(dǎo)因子,可抑制HIF-1α、微管和腫瘤血管生成,可能的作用機(jī)制包括細(xì)胞在G2/M期的聚集,抑制超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧的積累,增加p53和p21的表達(dá),以及細(xì)胞色素的線粒體釋放等[15]。2-ME2是一種耐受性良好的小分子藥物,口服具有活性,優(yōu)于其他化療藥物。

3 HIF-1α及其抑制劑在白血病方面的研究進(jìn)展

3.1 CLL CLL是西方國(guó)家最常見(jiàn)的成人白血病,其特征是大量成熟的克隆性B淋巴細(xì)胞在外周血、骨髓、脾臟等中積聚。在CLL中,HIF-1α促進(jìn)骨髓的新生血管生成,調(diào)節(jié)趨化因子受體和細(xì)胞黏附分子的表達(dá),包括關(guān)鍵的歸巢和遷移因子(如CXCR 4、CXCL 12等),從而維持CLL細(xì)胞在骨髓微環(huán)境內(nèi)的存活[16]。

TP53異常的CLL患者對(duì)以氟達(dá)拉濱為基礎(chǔ)的化療方案具有固有的抵抗力。針對(duì)此問(wèn)題,Griggio等[17]研究了BAY 87-22433在TP53異常的CLL細(xì)胞中的作用，結(jié)果顯示,與TP53野生型細(xì)胞相比,TP53異常的CLL細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)水平顯著升高，轉(zhuǎn)錄活性更強(qiáng),且BAY87-22433克服了TP53基因缺失的白血病細(xì)胞對(duì)氟達(dá)拉濱的耐藥問(wèn)題,與伊魯替尼聯(lián)合應(yīng)用具有很強(qiáng)的協(xié)同細(xì)胞毒作用,還可顯著減少骨髓中白血病細(xì)胞的浸潤(rùn),增加白血病細(xì)胞凋亡的比例。這些證據(jù)表明,HIF-1α抑制劑可作為一種有前途的CLL治療策略。

Valsecchi等[16-18]用EZN-2208治療CLL,發(fā)現(xiàn)EZN-2208可明顯抑制HIF-1α的表達(dá),從而損害CLL細(xì)胞中CXCL 12因子的定向趨化作用,減少CLL細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的黏附和在脾臟及骨髓中的定植,并可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間。Valsecchi等[19]還發(fā)現(xiàn),EZN-2208可增強(qiáng)CLL細(xì)胞對(duì)氟達(dá)拉濱誘導(dǎo)CLL細(xì)胞凋亡的敏感性,顯示出明顯的抗白血病活性。

3.2 慢性髓系白血病(CML) CML是一種以bcr-abl融合蛋白的存在為特征的骨髓增生性腫瘤。bcr-abl融合蛋白是一種活性酪氨酸激酶,可促進(jìn)CML細(xì)胞的復(fù)制和存活,而HIF-1α在CML干細(xì)胞的存活和維持中起重要作用。Zhang等[20]研究HIF-1α在CML的發(fā)生和維持中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn),由于HIF-1α的缺乏,導(dǎo)致了白血病干細(xì)胞(Leukemia stem cells,LSC)中細(xì)胞周期抑制因子p16InK4a、p19Arf、p57以及凋亡基因p53的表達(dá)增加,因此,抑制HIF-1α通路可能有效根除白血病干細(xì)胞,為開(kāi)發(fā)HIF-1α抑制劑治療CML提供理論基礎(chǔ)。

Cheloni等[21]的小鼠CML模型實(shí)驗(yàn)表明,ACF能減少白血病的發(fā)生及LSC維持,在體內(nèi)外對(duì)非CML造血細(xì)胞的影響較小。ACF還可減輕小鼠的整體CML負(fù)擔(dān),表現(xiàn)為脾腫大程度減輕,骨髓、外周血和肺中的白血病細(xì)胞減少。因此,ACF成為抑制LSC、防止CML復(fù)發(fā)的一種可能治療策略。Ng等[22]通過(guò)沉默HIF-1α基因,證明CML干細(xì)胞在缺氧條件下的維持是依賴HIF-1α的。CML細(xì)胞中的一些缺氧調(diào)節(jié)基因,尤其是廣泛參與生存和細(xì)胞黏附的基因,也可能是CML干細(xì)胞的治療靶點(diǎn)。因此,聯(lián)合抗BCR-ABL1和抗HIF-1α治療，在消除LSC和治愈CML方面前景廣闊。

Chen等[23]探討TPL在耐藥髓系白血病細(xì)胞系中的作用時(shí)提到,TPL通過(guò)下調(diào)HIF-1α和Nrf2的表達(dá),分別提高了耐藥細(xì)胞株HL60和K562對(duì)阿霉素及伊馬替尼的藥物敏感性,提示TPL對(duì)上述2種耐藥細(xì)胞株均具有高度毒性,且呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)TPL聯(lián)合這2種抗癌藥物時(shí),HIF-1α在mRNA和蛋白水平均下調(diào),下游基因如BNIP3、VEGF和CAIX在mRNA水平下調(diào),CXCR4在蛋白水平下調(diào),提示TPL可明顯影響HIF-1α及其下游靶基因的功能和表達(dá)。

此外,姜黃素作為一種印度香料,可通過(guò)阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖和侵襲以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。Monteleone等[24]采用SWATH-MS技術(shù)評(píng)價(jià)了亞毒性劑量姜黃素對(duì)K562細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示,姜黃素可誘導(dǎo)糖代謝相關(guān)蛋白持續(xù)減少,其中大部分是HIF-1α靶點(diǎn),其影響代謝酶譜的機(jī)制與miR-22介導(dǎo)的IPO7表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致HIF-1α活性降低有關(guān)。結(jié)果表明,miR-22/IPO7/HIF-1α軸可能是姜黃素的一個(gè)新的分子靶點(diǎn),為更好地定義姜黃素的治療活性和抗癌特性提供了新的見(jiàn)解。

3.3 ALL 在急性T淋巴細(xì)胞白血病中,HIF-1α促進(jìn)Notch1信號(hào)激活,導(dǎo)致細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥。有關(guān)急性B淋巴細(xì)胞白血病中HIF-1因子作用的數(shù)據(jù)較少,目前已經(jīng)證實(shí)的是HIF-1α由骨髓中的白血病B細(xì)胞表達(dá)[25]。

治療急性T淋巴細(xì)胞白血病的化療方法可有效減少腫瘤負(fù)荷,然而,由于白血病前干細(xì)胞的存在,使得疾病容易復(fù)發(fā);由于其獨(dú)特的低增殖狀態(tài),白血病前干細(xì)胞對(duì)現(xiàn)有化療藥物的敏感性較低。Gerby等[26]為鑒定靶向白血病前干細(xì)胞的化合物,通過(guò)高通量篩選的方法篩選出2-ME2,證實(shí)2-ME2可通過(guò)抑制Notch1下游效應(yīng)分子MYC的翻譯,阻止SCL/TAL1活性,從而消除白血病前干細(xì)胞的自我更新活性,但不影響MYC在正常的造血干祖細(xì)胞中的功能。此外,Zhang等[15]研究2-ME2在急性T淋巴細(xì)胞白血病的作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn),2-ME2可導(dǎo)致G2/M期細(xì)胞周期阻滯,引起急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡改變,還可通過(guò)上調(diào)p21蛋白、下調(diào)Bcl-2蛋白和下調(diào)功能失調(diào)的p53蛋白來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.4 AML AML是一種高度異質(zhì)性疾病,由多種染色體畸變和調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞分化及增殖的基因突變引起。Wang等[27]研究棘霉素在TP53突變的AML中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn),HIF-1α在突變的AML細(xì)胞中表達(dá)水平更高,與傳統(tǒng)的化療藥物和放射療法相比,棘霉素可選擇性地消除CD34+CD38-AML腫瘤干細(xì)胞,對(duì)白血病和淋巴瘤具有顯著的治療效果。此外,在人AML異種模型中,采用棘霉素短期治療可預(yù)防AML的連續(xù)移植。上述結(jié)果支持棘霉素優(yōu)先針對(duì)AML干細(xì)胞的觀點(diǎn)。

Zhe等[28]研究了2-ME2對(duì)于AML的生物活性,結(jié)果顯示,在AML中,HIF-1α的表達(dá)隨著2-ME2劑量的增加而降低,且VEGF、GLUT1和HO-1的表達(dá)也在轉(zhuǎn)錄水平受到抑制。此外,在相同濃度下,AML細(xì)胞對(duì)2-ME2的敏感性高于阿糖胞苷,而2-ME2對(duì)正常造血干細(xì)胞的作用弱于傳統(tǒng)的化療藥物。

當(dāng)前,維甲酸-三氧化二砷(ATRA-ATO)聯(lián)合治療是治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)的標(biāo)準(zhǔn)方案,治愈率較高,但目前出現(xiàn)了對(duì)砷劑的抗藥性,而且攜帶PLZF-RARA融合蛋白的APL患者對(duì)維甲酸治療存在部分抗藥性。有報(bào)道,在APL中,沉默HIF-1α可延緩白血病進(jìn)展,并與全反式維甲酸協(xié)同消除白血病干細(xì)胞[29]。因此,Coltella等[30]對(duì)EZN-2208進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)EZN-2208處理APL細(xì)胞后,HIF-1α靶基因的表達(dá)呈劑量依賴性下調(diào),這些基因參與了關(guān)鍵的促癌功能,如癌癥代謝、細(xì)胞遷移等,可抑制APL小鼠模型中白血病的進(jìn)展,延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間。與ATRA聯(lián)合使用時(shí),EZN-2208在清除白血病和根除白血病干細(xì)胞方面具有協(xié)同作用。

4 總結(jié)

HIF-1α可以作為判斷白血病預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,也可作為抗白血病的重要靶點(diǎn)。目前,大多數(shù)缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑已經(jīng)在實(shí)體瘤中進(jìn)行了研究,少量用于惡性血液病的臨床前模型測(cè)試。雖然HIF-1α抑制劑在白血病中的研究處于早期階段,但綜合現(xiàn)有文獻(xiàn)中關(guān)于缺氧誘導(dǎo)因子在白血病中作用和功能的分析,隨著研究的逐步深入,HIF-1α抑制劑有望能為目前無(wú)法治愈或?yàn)橐痪€治療成功后復(fù)發(fā)的患者提供一個(gè)可靠的治療選擇。