高 鵬,馬巧霞,朱金芳,銀 秀

0 引言

黃芩(Scutellariabaicalensis)為唇形科植物黃芩的干燥根,屬多年生草本植物,主要功效有清熱燥濕、消炎抗菌、抗氧化等[1-2]。黃芩苷作為黃芩的主要有效成分,具有抑菌抗炎、鎮(zhèn)靜、降壓、抗變態(tài)反應(yīng)等藥理作用,亦被作為黃芩和黃芩制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)成分[3-5]。目前,市銷的黃芩苷有30%～98%等不同的規(guī)格,根據(jù)黃芩苷的純度可以制成片劑(>70%)、膠囊(>90%)、沖劑(>92%)、針劑(>96%)等不同劑型[6]，應(yīng)用于不同領(lǐng)域。

目前,報(bào)道的黃芩苷的提取方法主要有煎煮法、溫浸法、超聲法、微波法等[7-9]。在提取工藝研究上,除提取率和純度外,低成本、環(huán)境友好型亦是實(shí)際生產(chǎn)中關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)采用煎煮法,一步酸沉,以黃芩苷含量作為考察指標(biāo),對(duì)影響提取率的工藝參數(shù)，如浸泡條件、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察,優(yōu)化了黃芩苷水提工藝,以期為生產(chǎn)實(shí)踐提供指導(dǎo)。

1 儀器與試藥

黃芩根,產(chǎn)自山東臨沂,經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院馬生軍副教授鑒定為黃芩(ScutellariabaicalensisLeorgi)的根;黃芩苷對(duì)照品(批號(hào):MVSI-16111113,成都曼思特生物科技有限公司,含量≥98.59%);其他試劑均為分析純。

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;W201電熱恒溫水浴鍋:上海申生科技有限公司;AL204-IC電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材預(yù)處理 黃芩根藥材粉碎,過(guò)20目篩后分裝于樣品袋中,備用。

2.2 黃芩苷提取率的計(jì)算 取篩后黃芩根粗粉10 g,以料液比1∶10和1∶5煎煮2次,時(shí)間分別為60 min和30 min,過(guò)濾,合并兩次提取液,用4 mol/L鹽酸調(diào)pH值至1～2,于80 ℃水浴保溫1 h,再靜置12 h,過(guò)濾,水洗至中性,40 ℃下干燥得黃芩苷粗品[10]。

注:M—黃芩苷粗品質(zhì)量(g);M0—黃芩根粗粉質(zhì)量(g)。

2.3 黃芩苷含量測(cè)定

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 參照文獻(xiàn)[11-12]的方法并加以改進(jìn)。

精密稱取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品2.1 mg,置10 ml容量瓶中,用50%乙醇溶解,定容,即得黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.207 mg/ml)。吸取儲(chǔ)備液625 μl于10 ml量瓶,定容,即得濃度為12.938 μg/ml的黃芩苷待測(cè)液。以50%乙醇作為空白對(duì)照,用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,選取最大吸收波長(zhǎng)作為黃芩苷的測(cè)定波長(zhǎng)。從圖1可知,在278 nm處黃芩苷對(duì)照品溶液有最大吸收,與唐海燕等[13]報(bào)道的結(jié)果相一致,故以278 nm作為本試驗(yàn)黃芩苷的測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 黃芩苷全波長(zhǎng)掃描

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液250、375、625、750、875 μl,分別用50%乙醇定容于10 ml量瓶中,既得濃度分別為 5.175、7.762、12.938、15.525、18.112 μg/ml 的對(duì)照品溶液。以50%乙醇溶液作空白對(duì)照,于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

以濃度C(μg/ml)為橫坐標(biāo),吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得黃芩苷對(duì)照品的線性回歸方程為:y=0.0316x+0.0766,r=0.999,由圖2看出,黃芩苷對(duì)照品在2.0～20 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 含量測(cè)定 精密稱取上述黃芩苷粗品50 mg,50%乙醇溶液溶解,定容于50 ml容量瓶中,過(guò)濾,取續(xù)濾液1 ml，置于50 ml容量瓶,定容[1]。以50%乙醇溶液作為空白對(duì)照,于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,計(jì)算黃芩苷的含量。計(jì)算公式為:

注:C為對(duì)應(yīng)的濃度;D為稀釋倍數(shù);V為吸取續(xù)濾液的體積;m為樣品質(zhì)量。

2.4 黃芩苷提取工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn) 試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[14]并加以改進(jìn)。稱取黃芩根粗粉每份10 g,采用煎煮法提取,以黃芩苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察浸泡條件(冷水加入、冷水浸泡4 h、沸水加入)、用水量(5+5、10+5、15+10、15+15倍)、提取時(shí)間(60+60、60+30、30+30、30+15 min)、提取次數(shù)(1、2、3次),初步篩選提取條件,結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出,浸泡條件對(duì)黃芩苷的含量影響最為明顯,料液比和提取時(shí)間次之,提取次數(shù)的影響最小。初步確定提取條件為:適量黃芩根粗粉加入10倍和5倍量的沸水煎煮2次,時(shí)間分別為60 min和30 min。

圖3 單因素試驗(yàn)篩選黃芩苷的提取條件

2.4.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)提取工藝中有較大影響的因素:提取用水量(A)、提取時(shí)間(B)、浸泡條件(C)進(jìn)行考察,每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平,篩選黃芩苷的最佳提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素與水平

黃芩藥材粗粉以每份10 g的量,稱取9份,按“2.2”、“2.3.3”的方法提取和計(jì)算黃芩苷的含量。正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

根據(jù)表2中的正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果可以看出,不同因素的不同水平對(duì)黃芩根中黃芩苷的含量均有一定的影響。

由表3可以得出,因素C(浸泡條件)各水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),因素A(料液比)、因素B(提取時(shí)間)各水平之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),即浸泡條件是影響黃芩苷含量的主要因素。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際,確定黃芩根中黃芩苷的最佳提取工藝為:用水量為10+5倍,沸水加入,煎煮2次,時(shí)間分別為60 min和30 min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.5 黃芩苷提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按照確定的最佳提取工藝,平行3份進(jìn)行工藝驗(yàn)證,計(jì)算黃芩苷的提取率和含量,結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明,該提取工藝下所得黃芩苷含量比較穩(wěn)定,耗資少,節(jié)約成本,且黃芩苷含量較高。

表4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)采用煎煮法,以黃芩苷的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過(guò)單因素試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)影響提取效果的主次因素順序?yàn)榻輻l件>料液比>提取時(shí)間>提取次數(shù),選取對(duì)黃芩苷提取率有較大影響的3個(gè)因素(浸泡條件、料液比、提取時(shí)間)進(jìn)行正交試驗(yàn)。通過(guò)數(shù)據(jù)分析,得到最適宜的提取工藝組合為C3A2B3,即加入黃芩藥材10+5倍的沸水,煎煮2次,時(shí)間分別為60 min和30 min。合并兩次提取液,將pH值用稀鹽酸調(diào)至1～2,80 ℃水浴30 min,靜置12 h后過(guò)濾,水洗至中性,40 ℃干燥得黃芩苷粗品。該條件下得到的黃芩苷收率可達(dá)15.08%,純度84.58%。與邵紅等[14]采用超聲法提取黃芩苷的得率16.52%相比,差異并不明顯。施春陽(yáng)等[15]以60%乙醇、1∶18的料液比于60 ℃、32 kHz超聲提取2 h,得到黃芩苷提取率11.84%,純度85%,在得率和純度相差不大的情況下,此法避免了有機(jī)溶劑的使用,更加環(huán)保經(jīng)濟(jì)。

黃芩本身含有多種酶[16],在溫度和濕度適宜的情況下,會(huì)使部分黃芩苷水解,影響收率。因此選用沸水加入,能有效抑制酶的活性,防止部分黃芩苷的水解。溶劑用量、提取時(shí)間和次數(shù)增加到一定程度時(shí),黃芩苷的含量由于雜質(zhì)的溶出反而會(huì)有所下降。本試驗(yàn)確定的水煎煮提取工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定,黃芩苷提取率和純度較高,且成本低,環(huán)境友好,適用于工業(yè)化生產(chǎn),具有良好的實(shí)際意義。