方歡樂,張 慧,陶炎炎,李瑤窈,陳衍斌

0 引言

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ),其可導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、缺血性腦卒中等阻塞性血管疾病，威脅著人類健康。我國中醫(yī)將AS的發(fā)病機(jī)制歸結(jié)為氣、血、津液紊亂,臟腑功能失調(diào)而形成痰證、瘀證等[1]。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]的干燥根,具有補(bǔ)血活血作用[2]?，F(xiàn)有研究表明，當(dāng)歸活血化瘀作用可對(duì)血液系統(tǒng)產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[3],但其作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。

中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)整合中藥材數(shù)據(jù)、中藥方劑數(shù)據(jù)、中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)、中藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)、疾病相關(guān)分子數(shù)據(jù)資源,采用人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)計(jì)算及可視化等方法和技術(shù),開展中藥(含方劑)靶標(biāo)預(yù)測(cè)及功能分析、 證候相關(guān)分子挖掘及功能分析等模塊,可建立的“中藥-成分-靶標(biāo)-疾病”多維分析平臺(tái),從分子水平揭示中藥藥效物質(zhì)與疾病作用關(guān)系,其研究路線見圖1。本研究采用TCMIP V2.0(http://www.tcmip.cn),探究當(dāng)歸治療動(dòng)脈粥樣硬化的活性成分及其可能的分子作用機(jī)制。

圖1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究路線圖

1 資料與方法

1.1 當(dāng)歸化學(xué)成分的篩選 在 TCMIP V2.0 的“中藥材數(shù)據(jù)庫”中,可得到關(guān)于當(dāng)歸藥材的化學(xué)成分以及相關(guān)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)。

1.2 候選靶標(biāo)來源及其靶標(biāo)預(yù)測(cè) 在功能列表中藥(含方劑)靶標(biāo)預(yù)測(cè)及功能分析界面中,在疾病檢索項(xiàng)下勾選“atherosclerosis” 構(gòu)建其疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。根據(jù)成藥性等級(jí),選擇目標(biāo)當(dāng)歸的化學(xué)成分庫，依據(jù)成藥性評(píng)價(jià)等級(jí),根據(jù)成藥性的優(yōu)劣,選擇相似性分?jǐn)?shù)≥0.8的成分為當(dāng)歸候選靶標(biāo)。對(duì)候選靶標(biāo)進(jìn)行基因功能挖掘,進(jìn)一步開展富集分析。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息 通過 TCMIP的中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘資源提供的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)的數(shù)據(jù)庫HAPPI、Reactome等，獲得當(dāng)歸作用靶標(biāo)與AS 疾病靶標(biāo)之間的PPI信息。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 選取中藥-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn);通過計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的連接度(Degree)、介度(Betweenness)和緊密度(Closeness),篩選網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)基因,構(gòu)建“當(dāng)歸-動(dòng)脈粥樣硬化”相互作用網(wǎng)絡(luò),并通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣饔?jì)算及基因功能和通路的富集分析,構(gòu)建“當(dāng)歸-化學(xué)成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路-疾病”的多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。

1.5 基因功能和通路富集分析 通過 TCMIP的中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘資源如GO(Gene ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等數(shù)據(jù)庫,對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)的基因和通路富集分析(選擇),P<0.05篩選差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物功能及過程,選取P值前20的關(guān)鍵通路信息。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸化學(xué)成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)及分析 通過TCMIP V2.0平臺(tái)對(duì)當(dāng)歸化學(xué)成分的分析結(jié)果可知:共收集了當(dāng)歸64個(gè)化學(xué)成分，主要含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、香豆素類、生物堿類、氨基酸、萜類等,預(yù)測(cè)當(dāng)歸的潛在靶標(biāo)數(shù)量為677個(gè)。對(duì)當(dāng)歸潛在靶標(biāo)進(jìn)行基因功能分析和通路富集分析。選擇P值前20的主要基因功能信息列于表1，即為當(dāng)歸候選靶標(biāo)基因所參與的生物學(xué)功能信息,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其功能多與細(xì)胞膜離子通道、GABA-A受體、電壓門控鈉離子通道、鈉、氯離子通道、核受體、類固醇激素受體、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)(NMDA受體)、氧化還原酶活性等相關(guān)。同時(shí)對(duì)當(dāng)歸潛在藥靶進(jìn)行通路分析,所得分析結(jié)果中,選擇P值前20的關(guān)鍵通路信息列于表2中,即為當(dāng)歸候選靶標(biāo)參與通路的信息分析表,發(fā)現(xiàn)主要在神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)、核受體轉(zhuǎn)錄、碳水化合物代謝、能量代謝、脂類代謝、RNA生物合成、維甲酸循環(huán)病、RORA(維甲酸孤核受體A)基因的表達(dá)、PPARA基因的表達(dá)等涉及多個(gè)系統(tǒng)的疾病?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)研究顯示，當(dāng)歸可產(chǎn)生保護(hù)心血管、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、平喘、調(diào)節(jié)平滑肌、抗腫瘤等作用[4],其對(duì)造血系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生的作用與當(dāng)歸候選靶標(biāo)參與通路信息分析是一致的。

表1 當(dāng)歸候選靶標(biāo)的功能信息

表2 當(dāng)歸候選靶標(biāo)參與通路的信息

2.2 當(dāng)歸治療動(dòng)脈粥樣硬化的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)、基因功能和通路富集分析

2.2.1 核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò) 通過整合分析的網(wǎng)絡(luò)分析模塊,基于PPI數(shù)據(jù),構(gòu)建當(dāng)歸潛在靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò),見圖2。圖中共得到56個(gè)與AS及藥物相關(guān)核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)。其中藥物作用直接靶標(biāo)23個(gè),疾病直接靶標(biāo)30個(gè),疾病與藥物間共有靶標(biāo)3個(gè)。表1列舉了degree排名前20的靶標(biāo)，以疾病直接靶標(biāo)為主的包括:ESR1、SCARB1、NR1H4、CEPT、PPARG、APOE、LCAT等。

藥物作用靶點(diǎn)的主要來源是疾病靶點(diǎn),由圖2可知,當(dāng)歸與AS共有的3個(gè)靶標(biāo)分別為PPARG 、MTTP、 PLA2G2A。其中PPARG是共有靶點(diǎn),同時(shí)是網(wǎng)絡(luò)中相互作用較高的靶點(diǎn)。PPARG主要負(fù)責(zé)脂類的分解代謝等,參與體內(nèi)包括脂肪細(xì)胞的分化、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化等病理生理過程。而AS的發(fā)病主要為脂質(zhì)浸潤(rùn)、炎性反應(yīng)。所以預(yù)測(cè)當(dāng)歸抗AS的靶點(diǎn)可能為PPARG。有報(bào)道，當(dāng)歸芍藥散具有抗AS作用,其機(jī)制可能與促進(jìn)其主動(dòng)脈斑塊內(nèi)PPARG表達(dá)有關(guān)[5]。

圖2 當(dāng)歸“藥物作用靶標(biāo)-動(dòng)脈粥樣硬化”相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2.2 基因功能分析 通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫的基因和功能分析,結(jié)果見表4、表5。當(dāng)歸的藥物靶標(biāo)和AS疾病靶標(biāo)基因功能分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸通過參與核受體活性、類固醇激素受體、抑制及激活細(xì)胞外配體門控離子通道、GABA氯離子通道活性、結(jié)合膽固醇、膽汁、參與調(diào)節(jié)突觸后膜氯離子電位、核受體轉(zhuǎn)錄輔酶活性、膽汁通道活性、與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、激活膽固醇通道、結(jié)合類固醇等多個(gè)相關(guān)條目改善AS。在通路富集中顯示，當(dāng)歸對(duì)抗AS的可能通路有核受體轉(zhuǎn)錄途徑、細(xì)胞類泛素化、高密度脂蛋白重塑、膽汁酸、膽汁鹽的代謝,調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖活化受體α(PPARα)活性基因的表達(dá)及類固醇、乳糜微粒、白色脂肪細(xì)胞的含量,參與炎癥因子信號(hào)通路及雌激素依賴基因的表達(dá)等。而現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)研究表明，高密度脂蛋白(HDL)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。目前已經(jīng)有人提出抑制膽固醇脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為提高HDL水平的一種方法[6]。炎癥因子也參與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)[7]。而PPARα作為核受體超家族的一員,可通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子及表面黏附分子的表達(dá)等對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化[8]。

表5 當(dāng)歸治療動(dòng)脈粥樣硬化核心靶標(biāo)通路富集分析

2.2.3 當(dāng)歸治療動(dòng)脈粥樣硬化的“中藥-成分-靶標(biāo)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析 基于圖2,采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣饔?jì)算與核心靶標(biāo)基因功能及核心靶標(biāo)通路的富集分析,建立當(dāng)歸治療動(dòng)脈粥樣硬化的“中藥-成分-靶標(biāo)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)果圖,見圖3。進(jìn)一步分析當(dāng)歸干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。

由圖3可知,當(dāng)歸的核心靶標(biāo)有26個(gè),當(dāng)歸藥材64種成分,其中17種有效成分直接或間接作用AS,直接作用的8種成分主要為有機(jī)酸類和揮發(fā)油類。軟脂酸通過調(diào)節(jié)PPARα、CCL2、MMP9作用于IL-4及IL-13信號(hào)通路，對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化性疾病。藁本內(nèi)酯、東莨菪堿內(nèi)酯通過MTTP、APOE作用干擾乳糜微粒作用,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,對(duì)抗AS。

現(xiàn)有研究報(bào)道,血脂異常升高是動(dòng)脈硬化引起心腦血管疾病的主要因素之一,當(dāng)歸揮發(fā)油具有一定的降脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[9],炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈硬化引起心腦血管疾病的主要因素之一[10],當(dāng)歸有機(jī)酸可通過降低炎癥因子的表達(dá),抑制炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化[11]。實(shí)驗(yàn)研究和網(wǎng)絡(luò)研究結(jié)果一致。

圖3 當(dāng)歸治療動(dòng)脈粥樣硬化的“核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

3 結(jié)論

AS的發(fā)病過程主要表現(xiàn)在動(dòng)脈血管中膽固醇的大量積累和慢性炎癥的產(chǎn)生,其目前發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說,包括脂質(zhì)浸潤(rùn)、炎性反應(yīng)、鈣超負(fù)荷學(xué)說、氧化應(yīng)激等[12]。在臨床治療AS 的過程中,中醫(yī)藥發(fā)揮了獨(dú)有的優(yōu)勢(shì),中醫(yī)藥具有全方位和多靶點(diǎn)的作用特征,通過辨證論治,根據(jù)證型進(jìn)行方劑加減,能夠?qū)S發(fā)生和發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生作用,臨床效果顯著。而且一些中藥復(fù)方或單味藥提取物一定程度上降低了心腦血管疾病的發(fā)病率[13]。

當(dāng)歸一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn),當(dāng)歸及含當(dāng)歸的復(fù)方制劑改善血液系統(tǒng)的作用廣泛，如當(dāng)歸芍藥散可治療非酒精性脂肪性肝病[14],當(dāng)歸芍藥散對(duì)缺血性腦卒中小鼠具有腦保護(hù)作用[15],當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療貧血的同時(shí)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[16-17]。岷當(dāng)歸有效成分當(dāng)歸揮發(fā)油和阿魏酸能減輕模型兔血管內(nèi)皮的損傷,對(duì)高同型半胱氨酸血癥致兔 AS 病變有防治作用[18-19]。本研究通過中醫(yī)藥整合平臺(tái)共篩選出當(dāng)歸的活性成分64 個(gè),其中8種有效成分直接作用于AS。研究顯示，當(dāng)歸的主要活性成分作用靶點(diǎn)主要包括炎癥基因靶點(diǎn)PPARG、CCL2、MMP9及脂質(zhì)基因靶點(diǎn)MTTP、APOE、LCAT等,主要涉及炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝環(huán)節(jié)。這些研究也顯示預(yù)測(cè)的機(jī)制與部分研究結(jié)果一致,具有較高的準(zhǔn)確性。本研究是基于中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)所做的預(yù)測(cè),具體的作用靶點(diǎn)及作用通路還需要實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。