艾依熱提·買買提，木拉提·熱夏提

0 引言

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis，CP/CPPS)是男性常見疾病之一，發(fā)病率在2.5%～16.0%之間，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。臨床主要表現(xiàn)為下腹疼痛、墜脹，同時出現(xiàn)排尿異常，表現(xiàn)為尿急、尿頻、排尿困難及夜尿等[2]。目前，CP/CPPS的發(fā)病機(jī)制和病因尚不清楚。多種理論對CP/CPPS的病理發(fā)展做了解釋，主要包括微生物感染、自身免疫理論、神經(jīng)源性炎癥理論、局部激素異常理論及尿液反流理論[3]。近年來，隨著CP/CPPS動物模型和臨床患者數(shù)據(jù)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明，自身免疫在CP/CPPS的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[4]。國內(nèi)外學(xué)者已通過不同方法成功制備了自身免疫性相關(guān)的CP/CPPS動物模型[5]。朱閩等[6]使用前列腺蛋白提純液輔以免疫佐劑等制備實(shí)驗(yàn)性自身免疫性前列腺炎(EAP)小鼠模型。同樣，尹學(xué)來等[7]按雙縮脲法測定蛋白含量，以生理鹽水稀釋再加等量完全弗氏佐劑乳化成功制備了Wistar大鼠EAP模型。因此，隨著EAP動物模型的發(fā)展，對后續(xù)的藥物干預(yù)研究治療過程起著至關(guān)重要的作用。

龍膽苦苷(Gentiopicrin)是一種環(huán)烯醚萜苷類化合物，是傳統(tǒng)中藥龍膽的主要活性成分之一。研究表明，龍膽苦苷具有抗炎抑菌、鎮(zhèn)痛、肝臟保護(hù)及抗腫瘤等多種活性，且龍膽顆粒(龍膽是其主要成分之一)能夠治療慢性前列腺炎[8-9]。但是，龍膽苦苷對慢性前列腺炎的作用及相關(guān)分子機(jī)制尚不清晰，因此，本研究采用弗氏佐劑誘導(dǎo)的CP/CPPS大鼠模型評價(jià)龍膽苦苷的抗慢性前列腺炎作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試藥 60只雄性成年SD大鼠(220～250 g)購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。龍膽苦苷購自成都瑞芬思生物科技有限公司(成都，中國)；IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2及PGE2 ELISA大鼠試劑盒購自達(dá)科為(北京，中國)；前列康片購自浙江康恩貝制藥股份有限公司(杭州，中國)；抗-p-p65、p65、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38和GAPDH(CST，美國)；RIPA蛋白裂解液(中)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(碧云天，中國)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IG(Abcam，英國)。

1.2 CP/CPPS大鼠模型建立 將60只雄性成年SD大鼠(220～250 g)隨機(jī)分為假手術(shù)組(C組)、模型組(M組)、龍膽苦苷150 mg/kg組(L組)、龍膽苦苷300 mg/kg組(E組)、龍膽苦苷600 mg/kg組(H組)及陽性藥組(P組)，每組10只。麻醉SD大鼠，剖開腹腔完全暴露前列腺，龍膽苦苷和模型組大鼠前列腺注射100 μl完全弗氏佐劑免疫誘導(dǎo)CP/CPPS大鼠模型，對照組注射等體積生理鹽水，術(shù)后縫合傷口，連續(xù)肌肉注射抗生素(氨芐青霉素，4×104U/d)4 d。龍膽苦苷組大鼠灌胃給予龍膽苦苷，假手術(shù)組(C組)和模型組(M組)均給予等體積的生理鹽水，陽性藥組灌胃給予前列康片500 mg/kg，1次/d，連續(xù)10 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱重并脫頸椎處死大鼠，解剖分離大鼠前列腺并稱重，計(jì)算前列腺器官指數(shù)。

1.3 HE染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死大鼠，解剖分離大鼠前列腺，將其取出并在4%多聚甲醛中固定24 h，然后石蠟包埋。在切片機(jī)上切成4 μm切片，二甲苯脫蠟，酒精脫水。然后，蘇木精染色3 min，曙紅染色1 min。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，以評估前列腺炎癥反應(yīng)。

1.4 ELISA檢測 采用ELISA法檢測大鼠前列腺組織中白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF-α)及COX-2、PGE2分泌水平，收集大鼠前列腺組織，加入生理鹽水0.5 ml，組織研磨儀勻漿，600×g離心15 min，收集上清，根據(jù)制造商的說明采用ELISA試劑盒檢測大鼠前列腺中IL-6、IL-1β、TNF-α及COX-2和PGE2的含量。

1.5 誘導(dǎo)型NO酶活性檢測 采用酶活性檢測試劑盒(南京建成，南京，中國)檢測前列腺組織上清iNOS的酶活性，收集大鼠前列腺組織，加入生理鹽水0.5 ml組織研磨儀勻漿，600×g離心15 min，收集上清，根據(jù)說明檢測大鼠前列腺iNOS的酶活性。

1.6 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測有關(guān)指標(biāo) 分離收集實(shí)驗(yàn)大鼠的前列腺組織，稱取約30 mg，加入1 ml蛋白裂解液，研磨儀組織勻漿，采用Western blot檢測前列腺組織p-p65、p65、p-ERK和ERK、p-JNK和JNK及p-p38和p38蛋白表達(dá)水平。根據(jù)說明提取組織總蛋白，采用BCA法(碧云天，中國)進(jìn)行蛋白定量，加入Loading buffer(4×)于100 ℃煮沸5 min，然后采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳條件：80 V，30 min；120 V，60 min。隨后采用100 V，90 min將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏佛乙烯(PVDF)膜(Millipore，美國)，用5% 脫脂乳室溫封閉60 min，TBST洗滌5次，每次5 min，用一抗(p-p65、p65、p-ERK和ERK、p-JNK和JNK及p-p38和p38及GAPDH，按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5 min/次，用二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IG和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IG，按1∶10 000稀釋)室溫孵育90 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用ECL化學(xué)發(fā)光法(Millipore，MA)顯影檢測，Image J分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺器官指數(shù)及病理學(xué)的影響 與C組相比，M組大鼠的前列腺器官指數(shù)顯著升高(P<0.05)，與M組相比，灌胃給予龍膽苦苷顯著降低CP/CPPS大鼠的前列腺器官指數(shù)(P<0.05)，見圖1。病理HE染色結(jié)果表明，與C組相比，M組大鼠前列腺基質(zhì)出現(xiàn)局灶性淋巴細(xì)胞浸潤、上皮明顯增厚、腔內(nèi)折疊及腺泡顯著變小和間質(zhì)增生，灌胃給予龍膽苦苷能夠顯著減輕CP/CPPS的病理學(xué)變化，包括局灶性淋巴細(xì)胞浸潤減少、上皮增厚及間質(zhì)增生抑制等，見圖2。

圖1 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺器官指數(shù)的影響

2.2 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織中炎癥因子表達(dá)的影響 采用ELISA法檢測大鼠前列腺組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平，結(jié)果表明，與C組相比，M組大鼠前列腺組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量顯著增加，灌胃給予龍膽苦苷能夠顯著降低CP/CPPS大鼠前列腺組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量(P<0.05)，見圖3。

圖2 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺病理學(xué)影響(HE病理染色結(jié)果)

圖3 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織中炎癥因子表達(dá)的影響

2.3 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織炎癥介質(zhì)的影響 采用ELISA法檢測大鼠前列腺組織中COX-2、PGE2的含量，結(jié)果表明，與C組相比，M組大鼠前列腺組織中COX-2和PGE2的含量顯著增加，灌胃給予龍膽苦苷顯著降低CP/CPPS大鼠前列腺組織中COX-2和PGE2的含量(P<0.05)，見圖4A、4B。同時，與C組相比，M組大鼠前列腺組織中iNOS酶活性顯著增加，灌胃給予龍膽苦苷顯著抑制CP/CPPS大鼠的前列腺組織中iNOS酶活性(P<0.05)。見圖4C。

2.4 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織中NF-κB信號通路活化的影響 采用Western blot法檢測大鼠前列腺組織中NF-κB信號通路分子的蛋白水平，結(jié)果表明，與C組相比，M組大鼠前列腺組織中p-p65蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，但p65蛋白表達(dá)水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，灌胃給予龍膽苦苷能夠顯著下調(diào)CP/CPPS大鼠前列腺組織p-p65的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，見圖5。

2.5 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織中MAPKs信號通路活化的影響 采用Western blot法檢測大鼠前列腺組織中MAPKS信號通路分子的蛋白水平，結(jié)果表明，與C組相比，M組大鼠前列腺組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK及p-p38/p38蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，灌胃給予龍膽苦苷顯著下調(diào)CP/CPPS大鼠前列腺組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK及p-p38/p38蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，見圖6。

3 討論

CP/CPPS病理機(jī)制復(fù)雜，隨著CP/CPPS動物模型和患者數(shù)據(jù)的增加，越來越多的研究認(rèn)識到自身免疫在CP/CPPS病理機(jī)制中的重要作用[10]。因此，本研究采用完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)的自身免疫性CP/CPPS動物模型評價(jià)了龍膽苦苷的抗CP/CPPS作用及相關(guān)分子機(jī)制。

圖4 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織中炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響

圖5 龍膽苦苷CP/CPPS大鼠前列腺組織中NF-κB信號通路活化的影響

CFA誘導(dǎo)的CP/CPPS動物模型與前列腺的病理組織變化密切相關(guān)，表現(xiàn)為明顯的前列腺受損、炎性細(xì)胞浸潤及水腫和細(xì)胞間質(zhì)纖維化，這些變化和之前的報(bào)道一致，而且這種模型復(fù)制方法易于操作[10]。同時，這些變化與非細(xì)菌性CP/CPPS患者臨床癥狀相一致，有助于CP/CPPS的病理機(jī)制和藥物干預(yù)研究。本研究表明，龍膽苦苷能夠顯著抑制CP/CPPS大鼠前列腺炎性細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫及纖維化，同時降低前列腺的器官指數(shù)，這表明龍膽苦苷對CP/CPPS具有潛在的治療價(jià)值。

近年來，越來越多的研究將注意力集中于炎癥因子及炎癥介質(zhì)在CP/CPPS病理機(jī)制中的作用[11]。IL-1β和TNF-α作為兩種重要的促炎因子，在CP/CPPS的病理發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[12]。IL-6作為機(jī)體炎癥反應(yīng)的主要免疫因子，能夠調(diào)節(jié)IL-2的產(chǎn)生及下游IL-1β和TNF-α的合成[13]。本研究結(jié)果表明，龍膽苦苷能夠抑制CP/CPPS大鼠前列腺中炎癥因子包括IL-1β、IL-6及TNF-α的產(chǎn)生。同時，IL-1β和TNF-α作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，能夠激活核因子-κB(NF-κB)信號通路，促進(jìn)促炎因子及炎癥介質(zhì)COX-2、PGE2及iNOS的產(chǎn)生和釋放[14-15]。本研究表明，龍膽苦苷也能夠抑制COX-2、PGE2的產(chǎn)生及iNOS活性。因此，龍膽苦苷可能通過抑制炎癥因子及炎癥介質(zhì)的釋放發(fā)揮抗CP/CPPS作用。

圖6 龍膽苦苷CP/CPPS大鼠前列腺組織中MAPKs信號通路活化的影響

NF-κB信號通路在機(jī)體的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)過程中起著至關(guān)重要的作用，正常情況下，p65或p50與IκBα形成共聚體存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到細(xì)胞外信號的刺激(IL-1β和TNF-α)，IκBα發(fā)生磷酸化并降解，p65或p50磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)節(jié)促炎因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)及COX-2、PGE2等炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[16]。除此之外，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其亞族主要包括JNK、ERK及p38，參與介導(dǎo)細(xì)胞的生長、分化及發(fā)育等多種過程，在機(jī)體炎癥調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用[17]。在本研究中，龍膽苦苷能夠抑制p65的磷酸化及JNK、ERK和p38磷酸化，因此，龍膽苦苷可能通過抑制NF-κB和MAPK信號通路的活化產(chǎn)生抗炎作用。

綜上所述，本研究表明，龍膽苦苷對慢性前列腺炎具有保護(hù)作用，并且這種作用可能與抑制NF-κB和MAPK信號通路激活有關(guān)。但是，龍膽苦苷是直接還是間接作用于NF-κB和MAPK信號通路及其他信號通路，尚需進(jìn)一步探討。