綦欣竹，毛安瓊，李正芬，袁雪梅，劉 慶，張 英

0 引言

1 材料與方法

1.1 動物選擇 實驗動物的應(yīng)用及實驗程序得到西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心實驗動物應(yīng)用管理委員會同意。選擇老齡健康雄性SD大鼠[生產(chǎn)許可證編碼：SCXK(川)2013-17]120只，18～20月齡，體重400～550 g，采用隨機數(shù)字表法分為4組(n=30)：對照組(C組)、體外循環(huán)組(T組)、體外循環(huán)+右美托咪定組(D組)、體外循環(huán)+生理鹽水組(NS組)。C組大鼠不做任何處理，T組大鼠僅建立體外循環(huán)模型，D組大鼠腹腔注射50 μg/kg右美托咪定后同T組，NS組大鼠腹腔注射等劑量的生理鹽水后同T組。

1.2 建立體外循環(huán)動物模型 采用50 mg/kg戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，待翻正反射消失后，行氣管插管，調(diào)節(jié)呼吸機參數(shù)，監(jiān)測大鼠生命體征。分離腹壁內(nèi)前動脈、尾動脈和右頸內(nèi)靜脈，以腹壁內(nèi)前動脈監(jiān)測動脈血壓，以尾動脈和右頸靜脈建立CPB。CPB主要由蓄血器、滾泵和實驗動物膜肺靜脈組成。預(yù)充液為4 ml，由乳酸林格氏液、6%羥乙基淀粉、甘露醇、碳酸氫鈉按11∶7∶1∶1的比例組成。當(dāng)激活凝血時間(ACT)>480 s時，CPB開始。開始灌注流量為20～40 ml/(kg·min)，逐漸增加至160～180 ml/(kg·min)。平均血流保持在100～120 ml/(kg·min)，平均動脈壓維持在60/100 mmHg。經(jīng)過90 min的流動，停止CPB，剩余的機器預(yù)充血或膠體流體被返回。然后注射1 mg魚精蛋白，拔除導(dǎo)管，縫合血管和切口。手術(shù)后，使用電熱墊和溫控?zé)羰勾笫篌w溫維持在37 ℃。

1.3 行為學(xué)測定 老齡大鼠于體外循環(huán)后3 d、5 d、7 d,進行行為學(xué)測定。

1.3.1 Morris水迷宮實驗 參考文獻[9]進行水迷宮實驗。Morris水迷宮測試采用直徑為160 cm、高度為50 cm的水池。水深31 cm，溫度保持在23 ℃。水池被分成4個大小相等的象限，每個象限的墻壁上都有一個獨特的彩色圖案作為參考。在目標(biāo)象限中心放置直徑為9 cm、高度為30 cm的圓形平臺，淹沒在水面以下1 cm處。大鼠在導(dǎo)航試驗前1天被放入水池中，游2 min以適應(yīng)迷宮。在每一次試驗中，大鼠都被引入一個迷宮，在4個指定的起點之一面對墻壁。迷宮上方放置了一臺連接電腦的攝像頭，記錄游泳軌跡、總游泳距離和尋找平臺的時間。如果大鼠在120 s內(nèi)沒有找到平臺，則記錄潛伏期為120 s。實驗結(jié)束后，這些大鼠被放置在平臺上15 s，以便學(xué)習(xí)和記憶。每只老鼠每天接受4次測試，每一次的起點都不同，試驗之間有30 min的休息時間。實驗持續(xù)5 d，記錄平均潛伏期和總距離，使用上海吉亮動物行為分析系統(tǒng)進行分析。在最后一次位置導(dǎo)航測試24 h后，平臺被移除，老鼠被允許自由游泳120 s，每只動物游1次。在120 s的時間框架內(nèi)記錄逃避潛伏期和穿越原平臺次數(shù)。使用ANY-maze系統(tǒng)5.26 (Stoelting Co.，Wood Dale,IL,USA)對計算機上運行的行為指標(biāo)進行實時自動記錄時間和運動路線數(shù)據(jù)的分析。

1.3.2 穿梭箱實驗 參考文獻[10]進行穿梭箱實驗。箱體由兩個相等的隔間(50 cm×25 cm×25 cm)組成，中間有一個黑色的有機玻璃隔板，隔板底部有一個正方形的開口(9 cm×9 cm)，可以在隔間之間自由移動。兩個隔間都配備了位于上側(cè)壁的光源(15 W)和網(wǎng)格地板，網(wǎng)格地板由19根不銹鋼棒串聯(lián)到主控制模塊(Letica LI-2900，西班牙)，能夠在每個隔間中獨立地提供連續(xù)的、緊急的電擊。大鼠在連續(xù)15 d的10次試驗中進行測試。每只大鼠置于同一個隔間里，在實驗開始前有5 min的探索時間。每個試驗包括1個10 s的警告信號和一個燈泡(條件刺激，CS)，接著是1個3 s 0.3～0.5 mA的電擊(非條件刺激，UCS)和25個50 s的試驗間隔。在CS期間，大鼠移動到盒子的另一邊即認(rèn)為是做出了回避反應(yīng)。那些在3 s UCS期逃脫電擊的大鼠視為有逃脫反應(yīng)。對主動回避反應(yīng)次數(shù)、主動及被動回避反應(yīng)潛伏期進行分析。

1.3.3 曠場實驗 參考文獻[11]進行曠場實驗。使用高為45 cm、底為40～40 cm的黑色盒子，盒子中心上方有1個4 W的冷光源。動物活動記錄使用上海吉亮動物行為分析系統(tǒng)(上海，中國)。慢病毒注射后1周進行行為測試。將大鼠置于野外中央，利用紅外攝像系統(tǒng)和視頻合成器記錄其在光照條件下的活動。利用計算機分析系統(tǒng)分析運動軌跡。分析的行為變化包括總爬行距離、尾數(shù)和活動。每次實驗后，用75%的酒精溶液清洗盒子內(nèi)部，去除老鼠身上的氣味，以免影響下一只大鼠的行為。每只大鼠實驗結(jié)束后均將其糞便及尿液清理干凈，并用75%酒精擦拭場地3次。

1.4 采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定大鼠血漿中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醇(CORT)濃度 各組大鼠行為學(xué)測試結(jié)束后，隨機選取5只大鼠，抽取心臟血2 ml,置于肝素管內(nèi)，6 ℃條件下3 000 r/min離心15 min后取血漿，分裝置于-80 ℃保存待測。在室溫下，將樣品和稀釋液加入孔中，生物素抗體加入孔中，洗滌后加入HRP和生物素顯色液，最后加入終止液。在450 nm波長下測定各孔的吸光度(OD)。

1.5 采用蛋白印跡法(Western blot)檢測大鼠海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的表達 各組大鼠行為學(xué)測試結(jié)束后，隨機選取5只大鼠，采取靜脈血后，取海馬。隨后，用10% SDS-PAGE分離蛋白。使用PageRuler Plus預(yù)染色蛋白梯子(Thermo Fisher Scientific,Inc.)作為蛋白標(biāo)記加載，并估計樣品的分子量。蛋白被轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室溫下5%脫脂乳封閉2 h后，將PVDF膜與以下一抗孵育，兔BDNF多克隆抗體(稀釋度1∶1 000，Biorbyt公司，英國)、兔ERK多克隆抗體(稀釋度1∶800，Santa Cruz公司，美國)、兔CREB多克隆抗體(稀釋度1∶1 000，Biorbyt公司，英國)、β-actin(稀釋度1∶2 000，Santa Cruz公司，美國)，在4 ℃過夜。然后將膜與適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊孵育，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶6 000，北京中杉金橋科技公司)室溫?fù)u床孵育1 h，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育后顯影照相，在室溫下1 h。最后，用化學(xué)發(fā)光法觀察條帶。每個實驗重復(fù)6次。用Quantity one 圖像分析軟件(美國Bio Rad公司)測定BDNF、ERK及CREB蛋白的表達。

1.6 采用免疫組化SP法檢測海馬BDNF、ERK及CREB的陽性神經(jīng)元計數(shù) 各組大鼠行為學(xué)測試結(jié)束后，隨機選取5只大鼠，取大鼠海馬組織。參照說明書步驟進行操作：在海馬區(qū)隨機選擇8個視野，用顯微鏡圖像分析系統(tǒng)下的目鏡，400倍顯微計數(shù)，計算海馬BDNF、ERK及CREB的陽性細(xì)胞的平均數(shù)。

北京城什剎海前海南頭，煤灰土新墊就一片場坪，白日照著，有一圈沒事可做的閑人，皆為一件小小熱鬧粘合在那里。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試逃避潛伏期和穿越原平臺次數(shù) 與C組比較，T組、D組、NS組大鼠術(shù)后各時點逃避潛伏期延長，穿越原平臺次數(shù)減少(P<0.05)；與T組、NS組相比較，D組大鼠術(shù)后各時點逃避潛伏期縮短，穿越原平臺次數(shù)增加(P<0.05)；與術(shù)前比較，T組、D組、NS組大鼠術(shù)后各時點逃避潛伏期延長，穿越原平臺次數(shù)減少(P<0.05)；T組與NS組術(shù)后各時點逃避潛伏期和穿越原平臺次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 四組大鼠術(shù)后各時點逃避潛伏期和穿越原平臺次數(shù)的比較

2.2 穿梭箱實驗測試主動回避反應(yīng)次數(shù)及主動及被動回避反應(yīng)潛伏期 與C組比較，T組、D組，NS組大鼠術(shù)后各時點主動回避反應(yīng)次數(shù)減少，主動及被動回避反應(yīng)潛伏期延長(P<0.05)；與T組、NS組相比較，D組大鼠術(shù)后各時點主動回避反應(yīng)次數(shù)增加，主動及被動回避反應(yīng)潛伏期縮短(P<0.05)；與術(shù)前比較，T組、D組、NS組大鼠術(shù)后各時點主動回避反應(yīng)次數(shù)減少，主動及被動回避反應(yīng)潛伏期延長(P<0.05)；T組與NS組，術(shù)后各時點主動回避反應(yīng)次數(shù)及主動、被動回避反應(yīng)潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 四組大鼠術(shù)后各時點主動回避反應(yīng)次數(shù)及主動、被動回避反應(yīng)潛伏期比較

2.3 曠場實驗測試直立次數(shù)和中央格停留時間 與C組比較，T組、D組、NS組大鼠術(shù)后各時點直立次數(shù)減少，中央格停留時間延長(P<0.05)；與T組、NS組相比較，D組大鼠術(shù)后各時點直立次數(shù)增多，中央格停留時間縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與術(shù)前比較，T組、D組、NS組大鼠術(shù)后各時點直立次數(shù)減少，中央格停留時間延長(P<0.05)；T組與NS組術(shù)后各時點直立次數(shù)和中央格停留時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 四組大鼠術(shù)后各時點直立次數(shù)和中央格停留時間比較

2.4 采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定大鼠血漿中CRH、ACTH和CORT濃度 與C組比較，T組、D組、NS組大鼠術(shù)后各時點血漿中CRH、ACTH和CORT濃度升高(P<0.05)；與T組、NS組相比較，D組大鼠術(shù)后各時點血漿中CRH、ACTH和CORT濃度降低(P<0.05)；T組與NS組術(shù)后各時點血漿中CRH、ACTH和CORT濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 四組大鼠術(shù)后各時點血漿中CRH、ACTH和CORT濃度的比較(n=5)

2.5 Western-blot檢測大鼠海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的表達 與C組比較，T組、D組、NS組大鼠術(shù)后各時點海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的表達降低(P<0.05)；與T組、NS組相比較，D組大鼠術(shù)后各時點海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的表達升高(P<0.05)；T組與NS組術(shù)后各時點海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 四組大鼠術(shù)后各時點海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的比較(n=5)

2.6 采用免疫組化法檢測海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的陽性神經(jīng)元計數(shù) 與C組比較，T組、D組、NS組大鼠術(shù)后各時點海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的陽性神經(jīng)元計數(shù)降低(P<0.05)；與T組、NS組相比較，D組大鼠術(shù)后各時點海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的陽性神經(jīng)元計數(shù)升高(P<0.05)；T組與NS組術(shù)后各時點海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的陽性神經(jīng)元計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6、圖1。

表6 四組大鼠術(shù)后各時點海馬BDNF、ERK及CREB蛋白陽性神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果的比較(個)

3 討論

譫妄和術(shù)后認(rèn)知功能障礙現(xiàn)統(tǒng)稱為PND，已成為常規(guī)外科手術(shù)后最常見的并發(fā)癥，尤其是老年人，預(yù)后較差，對于預(yù)先存在神經(jīng)退行性變患者的PND的1年死亡率較高。目前，還沒有行之有效的PND治療方案。本研究參照文獻[12]選擇18～20月齡大鼠作為研究對象，模擬臨床老年患者病理生理狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠體外循環(huán)術(shù)后3 d、5 d、7 d逃避潛伏期延長，穿越原平臺次數(shù)減少，主動回避反應(yīng)次數(shù)減少，主動及被動回避反應(yīng)潛伏期延長，直立次數(shù)減少，中央格停留時間延長，表明大鼠體外循環(huán)術(shù)后出現(xiàn)圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知功能障礙，模型制備成功。

圖1 大鼠海馬BDNF、ERK及CREB蛋白免疫組化照片(400×)

大量的臨床資料證實HPA軸基因與應(yīng)激狀態(tài)之間有聯(lián)系。HPA軸激活后可使CRH的合成與釋放。下丘腦區(qū)還分泌另一種應(yīng)激激素-抗利尿激素，其與CRH協(xié)同作用，刺激ACTH分泌。PVN依賴其他下丘腦核(如弓狀核、背內(nèi)側(cè)下丘腦核、視前區(qū))和其他腦核(如杏仁核等)的輸入，與CRH分泌的正性刺激整合在一起。另一方面，海馬和前額葉皮層抑制PVN的活性，進而抑制HPA軸的活性[13]。HPA軸還可與其他應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)肽、胺和氨基酸系統(tǒng)相互作用，但人類HPA軸，尤其是CRH可能會被遺傳或環(huán)境因素永久激活，使人容易受到環(huán)境壓力的影響，從而在不同程度上進一步激活HPA軸。激活的HPA軸可能通過CRH的中心投射和/或皮質(zhì)類固醇循環(huán)水平的增強來影響情緒，而HPA軸不同水平上的SNP可能是大腦對皮質(zhì)醇敏感性變化的基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)，HPA軸失調(diào)降低了第二信使環(huán)核苷酸(cGMP和cAMP)的水平，進而降低了CREB和BDNF的磷酸化表達，進一步加重了阿爾茨海默病患者記憶和學(xué)習(xí)障礙[14]。

BDNF在神經(jīng)元的存活、生長和分化中起著重要的作用。BDNF水平的降低，尤其是在紋狀體中，被認(rèn)為在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用。在亨廷頓氏舞蹈癥患者死后腦組織中觀察到腦內(nèi)BDNF水平的降低[15]。越來越多的證據(jù)表明，BDNF在人腦中的多態(tài)性和BDNF表達的減少與AD的發(fā)病機制密切相關(guān)。BDNF基因的多態(tài)性(C270T和Val66Met)可引起B(yǎng)DNF的高表達從而減緩了AD患者的認(rèn)知能力下降。這表明大腦BDNF水平可以作為一種新的評估AD進展的標(biāo)志物。因此，可以考慮通過直接補充BDNF或間接刺激BDNF表達來增加BDNF水平，作為AD改善認(rèn)知功能潛在的疾病治療方法。此外，BDNF基因還可改善Aβ前體蛋白(APP)轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。ERK和CREB信號分子參與認(rèn)知功能。ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族成員，激活CREB，調(diào)節(jié)細(xì)胞過程，調(diào)節(jié)長期突觸可塑性，穩(wěn)定新記憶[16]。CREB是ERK的重要轉(zhuǎn)錄因子，與許多與學(xué)習(xí)、記憶和突觸可塑性相關(guān)的神經(jīng)元基因的啟動子區(qū)域結(jié)合[17]，其磷酸化促進了細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶和細(xì)胞周期蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達。有絲分裂需要ERK活性，但如果在G2/M期ERK活性過高，則會阻止有絲分裂進入并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定預(yù)處理老齡大鼠體外循環(huán)術(shù)后3 d、5 d、7 d，血漿中CRH、ACTH和CORT濃度降低，海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的表達和陽性神經(jīng)元計數(shù)升高，表明給予右美托咪定后，可以降低應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)海馬BDNF、ERK及CREB蛋白的表達，從而改善圍術(shù)期術(shù)后認(rèn)知功能障礙。其機制可能是:體外循環(huán)應(yīng)激刺激下，下丘腦室旁核處CRH表達上調(diào)，再以旁分泌或自分泌的方式作用CRH-R1，進一步促進自身分泌。同時刺激垂體前葉細(xì)胞ACTH釋放入血，ACTH又促進腎上腺皮質(zhì)的組織增生以及CORT的生成和分泌[18]。高血漿皮質(zhì)酮可引起海馬內(nèi)BDNF下調(diào)，下調(diào)的BDNF蛋白可直接與TrkB結(jié)合抑制ERK蛋白表達，使得下游的轉(zhuǎn)錄因子CREB下調(diào)，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定由于激活延髓孤束核中突觸后α2受體，導(dǎo)致交感神經(jīng)發(fā)放沖動現(xiàn)象降低，交感張力抑制，從而降低應(yīng)激反應(yīng)[20]，因此，本研究結(jié)果表明，右美托咪定可通過降低體外循環(huán)大鼠應(yīng)激反應(yīng)抑制下丘腦室旁核處CRH分泌，使得垂體前葉細(xì)胞ACTH釋放入血減少以及CORT分泌減少，導(dǎo)致海馬BDNF、ERK及CREB蛋白表達上調(diào)，從而改善圍術(shù)期術(shù)后認(rèn)知功能障礙，但右美托咪定是否通過其他信號通路改善圍術(shù)期術(shù)后認(rèn)知功能障礙，有待進一步研究。

綜上所述，右美托咪定可改善體外循環(huán)后老齡大鼠圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙，其機制可能與抑制HPA軸，激活海馬BDNF-ERK-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。