范超宇(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

0 引言

真菌是環(huán)境中常見的一種真核微生物，它常常定居于人類皮膚及黏膜，可以不引起免疫反應(yīng)，在人類免疫系統(tǒng)功能正常時(shí)可與人類共存[1-2]，然而，在免疫功能損傷、人類宿主的屏障被破壞的時(shí)候，真菌便可以侵犯人體，引起真菌感染[1]。與其他微生物感染相比，在臨床中對真菌感染的認(rèn)識較淺、診斷的方法不多、大多數(shù)患者不能得到早期診治。在相關(guān)統(tǒng)計(jì)中，世界上150萬種真菌里有400多種可以引起人類的嚴(yán)重感染。侵襲性真菌感染每年導(dǎo)致160萬人死亡，死亡的人數(shù)約等于瘧疾和結(jié)核[3]。大部分IPFD病人本身有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，并且診斷與治療不及時(shí)，導(dǎo)致預(yù)后差，IFIs 患者人數(shù)持續(xù)上升[4]。酵母菌類的真菌感染占90%以上，有念珠菌類Candida spp.、毛孢子菌類Trichosporonspp.、白地霉Geotrichum、隱球菌類Cryptococcus spp.和紅酵母類Rhodotorula spp.等[4]。感染最常見的真菌類型是念珠菌，其死亡率大致為15%-35%，發(fā)展中國家甚至有高達(dá)40%的死亡率[4-6]；毛孢子菌是導(dǎo)致血液病患者真菌敗血癥最主要的真菌，感染死亡率高達(dá)60%至80%[7]；紅酵母常導(dǎo)致導(dǎo)管相關(guān)感染，死亡率約9.1%[8]；白地霉類真菌感染常由重度免疫功能損傷所致[9]。肺真菌感染相關(guān)研究顯示，在非惡性血液疾病患者中，排名靠前的肺真菌病依次為肺曲霉感染(37.9%)，肺念珠菌感染(34.2%)，肺隱球菌感染(15.6%)，肺孢子菌感染。感染曲霉病的病死率可高達(dá)80%以上[10-11]。

近些年由于自然、社會(huì)環(huán)境不斷地發(fā)生變化，主要致病真菌病原譜在不斷地改變。除了常見的真菌感染，許多之前沒有致病性的環(huán)境真菌發(fā)生了進(jìn)化、變異，成為了致病真菌，甚至成為了多重耐藥的強(qiáng)致病菌。耳念珠菌Candida auris就是近年來的超級真菌，國際傳染病領(lǐng)域?qū)ζ鋸V泛關(guān)注。它對大多常用抗真菌藥物耐藥，且確診困難，在醫(yī)院相關(guān)場所存活時(shí)間長，傳播范圍廣，可引起暴發(fā)式感染，使其成為世界范圍內(nèi)診斷與治療的難點(diǎn)，它的致死率高于50%[12]。此真菌從2009年至今已傳播至18個(gè)國家[13-14]，侵襲性真菌感染的早期鑒別與診斷尤為重要，對患者預(yù)后有著重要的影響，現(xiàn)今診斷技術(shù)及其未來發(fā)展都是值得關(guān)注的。

1 傳統(tǒng)的檢查方法較局限

組織病理學(xué)檢查及微生物培養(yǎng)是真菌感染疾病的傳統(tǒng)與直接的檢測方法。但是有下列缺點(diǎn)：(1)如果獲取的標(biāo)本來自非無菌部位，則不能區(qū)分真菌污染、定植和感染，不能將其作為確診的依據(jù)；如果以侵入性檢查從無菌部位獲取待測樣本，則普通病人配合度低，重癥病人實(shí)施操作難度高；(2)培養(yǎng)需要較長時(shí)間，需要多次培養(yǎng)，部分鏡下檢驗(yàn)需要由經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)人員操作。雖然新型培養(yǎng)基、自動(dòng)化血培養(yǎng)系統(tǒng)能降低微生物培養(yǎng)時(shí)間，但沒有明確證據(jù)證明此類新進(jìn)展能提升診斷敏感性[15]；(3)組織病理學(xué)檢查也是常用的診斷方法，但也缺乏敏感性和精確性，例如一種菌種，在鏡下會(huì)呈現(xiàn)不同形態(tài)。當(dāng)需要根據(jù)菌種選擇藥物，將曲霉與其他真菌區(qū)分時(shí)，組織病理學(xué)結(jié)果常會(huì)出現(xiàn)問題 。

相比于組織培養(yǎng)，直接鏡檢更快捷，成本也更低。但主觀因素對直接鏡檢影響較大，且需要較高的檢驗(yàn)技術(shù)，并且陰性不能明確排除真菌感染。影像學(xué)檢查特異程度較低，有時(shí)不能排除腫瘤及其他感染，并且在晚期才有較大特異征象，臨床意義有限。

2 血清學(xué)檢查又稱間接檢測方法

侵襲性真菌感染血清學(xué)檢測主要有兩種。第一種為抗原檢測，有G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)、Mn(念珠菌甘露聚糖)實(shí)驗(yàn)、GXM(隱球菌莢膜多糖)實(shí)驗(yàn)等。第二種為抗體檢測，有特異性IgM、IgG抗體檢測。

G實(shí)驗(yàn)檢測的是真菌細(xì)胞壁的1-3-β-D葡聚糖，1-3-β-D葡聚糖是大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的組成部分，在真菌中是一種非特異成分，而在其他微生物和人類細(xì)胞中沒有BDG。真菌在被人體免疫系統(tǒng)消滅破壞后可以在一段時(shí)間內(nèi)釋放出BDG至血液、胸腔積液、腹腔積液、腦脊液、尿液等體液中。G實(shí)驗(yàn)是一種非特異性的篩查技術(shù)(隱球菌和接合菌除外)，已經(jīng)公認(rèn)為肺真菌感染的微生物學(xué)依據(jù)[16]。G實(shí)驗(yàn)還可大致鑒別其是否為定殖菌。G實(shí)驗(yàn)可分為三代。第一代和第二代樣本采用加熱和稀釋的方法，最后一代使用堿處理，第三代可以減少互相反應(yīng)，提高準(zhǔn)確度。第三代G實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)顯色法，檢驗(yàn)時(shí)間約為1h。第三代穩(wěn)定性高、抗干擾能力強(qiáng)、準(zhǔn)確度高。同時(shí)在侵襲性感染早期診斷G實(shí)驗(yàn)意義很大。但G實(shí)驗(yàn)也有缺點(diǎn)，患者如果用纖維素膜進(jìn)行血液透析，或者樣本接觸紗布等含有葡聚糖的物品，G實(shí)驗(yàn)可能出現(xiàn)假陽性；患者使用抗菌藥物如頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢唑林、甲氧芐啶、頭孢吡肟等；患者靜脈輸注白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白；標(biāo)本溶血、脂血、黃疸；癌癥患者使用多糖類抗癌藥，化放療破壞黏膜致胃內(nèi)容物的葡聚糖或定殖真菌入血等也可致假陽性；此外，因?yàn)镚實(shí)驗(yàn)的檢測過程與內(nèi)毒素很類似，故可被血中革蘭陰性菌的內(nèi)毒素干擾，引起假陽性[3]。相關(guān)研究提示：在G實(shí)驗(yàn)陽性的病例中，真菌培養(yǎng)陽性率為81.0%，而在G實(shí)驗(yàn)含量正常的病例中，該比率為54.0%；就真菌培養(yǎng)結(jié)果來看，G實(shí)驗(yàn)的敏感度是48.3%，特異度是95.0%。G實(shí)驗(yàn)雖有一定的假陽性率，但其敏感度，特異度比真菌培養(yǎng)高，若G實(shí)驗(yàn)與GM實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢驗(yàn)，則能進(jìn)一步提升真菌診斷率，對于侵襲性肺部真菌感染的診斷有很大幫助[28]。

GM實(shí)驗(yàn)檢測的是半乳甘露聚糖。半乳甘露聚糖呈水溶性，對熱穩(wěn)定，主要產(chǎn)生于曲霉菌。曲霉菌在體內(nèi)及體外生長實(shí)驗(yàn)中都可以釋放出該抗原，早期由菌絲分泌釋放，進(jìn)入體液中，能持續(xù)1至8周。因此在真菌感染患者的血清、尿液、腦脊液及BALF等體液中都可以檢測出該種抗原的存在，因此本法常用于曲霉屬感染的篩查。國內(nèi)外指南建議，患有血液病、重癥、腫瘤，或者進(jìn)行器官移植手術(shù)等的高?；颊呖梢允褂肎M實(shí)驗(yàn)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，GM實(shí)驗(yàn)對肺曲霉病的診斷價(jià)值非常大。

念珠菌甘露聚糖為念珠菌細(xì)胞壁主要成分，是念珠菌感染的生物標(biāo)志物，與念珠菌免疫反應(yīng)有關(guān)。歐洲權(quán)威感染相關(guān)指南建議，念珠菌甘露聚糖實(shí)驗(yàn)檢測念珠菌的多種感染[17]。Mn實(shí)驗(yàn)陽性一般較血培養(yǎng)陽性早6-7天[18]。

對于抗體的檢測，歐洲權(quán)威學(xué)會(huì)與指南強(qiáng)烈推薦肺泡灌洗液GM實(shí)驗(yàn)和血IgG 抗體檢測，美國傳染病學(xué)會(huì)最新指南推薦曲霉IgG抗體用于慢性空洞性肺曲霉病的診斷[16]。所以曲霉抗體檢測可以作為GM實(shí)驗(yàn)的重要補(bǔ)充，增加確診率。

真菌感染血清學(xué)檢測也有一些缺點(diǎn)：(1)葡聚糖等成分分布于環(huán)境中各個(gè)位置，因此血清學(xué)檢測易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[15,28]；(2)不能精確地鑒定菌種；(3)此法不能檢驗(yàn)隱球菌和接合菌的感染，因?yàn)樗鼈兤暇厶呛亢苌賉19]；(4)不同循環(huán)抗原與抗體之間可能有交叉反應(yīng)[20]；(5)由于抗真菌治療會(huì)導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁釋放更少的半乳甘露聚糖，因此對于經(jīng)驗(yàn)性抗真菌治療的患者GM實(shí)驗(yàn)沒有普通患者準(zhǔn)確[21]。

3 未來真菌診斷技術(shù)的發(fā)展方向?yàn)榉肿釉\斷

傳統(tǒng)方法在早期診斷，快速診斷，精準(zhǔn)診斷中都有著各種劣勢。早期，快速診斷能夠盡早地展開針對性的臨床治療，無論是痰培養(yǎng)，組織病理，真菌抗原，還是抗體檢測，DNA檢測，都不能確定菌種，定量測定，實(shí)現(xiàn)耐藥性檢測等，進(jìn)而影響患者的預(yù)后。現(xiàn)今新型分子診斷技術(shù)不斷出現(xiàn)，為臨床診斷提供了新的機(jī)會(huì)與幫助，其中包括：傳統(tǒng)PCR、RT-PCR、MALDI-TOF MS、恒溫?cái)U(kuò)增、測序等，它們有著越來越多的優(yōu)勢。

MALDI-TOF MS具有可檢測菌種種類多，一次檢測費(fèi)用較少，特異性高，一次檢測樣本多，時(shí)間短，可多次檢測等特點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)在全國大型醫(yī)院開展使用。因其可以精確識別蛋白譜，MALDI-TOF MS能對絲狀菌和酵母菌快速進(jìn)行鑒別[22]。現(xiàn)在的重點(diǎn)研究方向之一是識別耐藥菌株及其分子分型，但仍不成熟，以往外國對于儀器的研發(fā)具有壟斷地位，隨著我國對科研的重視，對相關(guān)儀器將投入更多研究，將來越來越多的國產(chǎn)儀器會(huì)發(fā)揮作用。

和前面的方法相比，核酸診斷如PCR，恒溫?cái)U(kuò)增具有特異性高、靈敏度高、檢測時(shí)間短等特點(diǎn)，是真菌感染診斷新的強(qiáng)力助手，使識別之前難以培養(yǎng)鑒定的真菌變成可能，還可以進(jìn)行耐藥性及其他快速測定，是未來具有很大前景的技術(shù)手段。

核酸診斷有兩個(gè)過程，它們分別為臨床患者DNA提取與核酸擴(kuò)增。只有DNA成功提取，才能保證核酸擴(kuò)增的進(jìn)行。真菌細(xì)胞壁由甘露聚糖、糖蛋白、幾丁質(zhì)、葡聚糖組成，它們組成了堅(jiān)固的屏障，通過普通方法難以打開。目前沒有簡易可行的、普及的手段及標(biāo)準(zhǔn)，因此提取真菌的DNA很難，這是分子診斷行業(yè)前進(jìn)的主要障礙，也是真菌感染核酸診斷領(lǐng)域研究的重點(diǎn)[23]。此外提取DNA常引起真菌診斷假陽性，相關(guān)研究顯示，3.3%假陽性是DNA在提取過程中出現(xiàn)[24]。今后真菌感染的DNA提取應(yīng)該向智能、便捷的方向發(fā)展。

對于PCR和熒光PCR擴(kuò)增，還沒有食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的真菌感染PCR 檢測手段，但已有許多廣泛使用的自行研發(fā)的PCR檢測方法，有研究選入 54 項(xiàng)共有 5000 例患者，此研究發(fā)現(xiàn)血清樣本PCR敏感性與特異性在“確診”或“可能”的侵襲性真菌感染中分別為 95%和 92%[24]。一項(xiàng)PCR診斷真菌感染的比較傳統(tǒng)的診斷方法是，先使用相對保守的引物(例如念珠菌，曲霉菌等真菌)檢測有無真菌感染，之后再使用特殊的引物(例如真菌種特異性引物)或其他方法(比如測序或限制性內(nèi)切酶分析)來精確診斷[25-26]。與鏡下檢查、血液標(biāo)本檢查的方法相比，核酸診斷的結(jié)果更迅速、更準(zhǔn)確。因?yàn)楹怂釞z測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，可以使用臨床樣本試驗(yàn)區(qū)別感染和定殖，還能連續(xù)監(jiān)測用藥的結(jié)果。熒光PCR能顯著提高靈敏度并大幅降低氣溶膠污染，而終點(diǎn)PCR較差。但熒光PCR的檢測試劑和儀器都是高費(fèi)用的技術(shù)，終點(diǎn)PCR價(jià)格相對低廉。

臨床上能否快速確診疾病，明確感染病原體，對于患者的預(yù)后和花費(fèi)有著至關(guān)重要的影響。傳統(tǒng)組織培養(yǎng)，血清學(xué)檢查等方法均有不能鑒定菌種，無法定量，無法判斷耐藥性等缺點(diǎn)。越來越完善的分子生物及生物傳感器診斷手段會(huì)進(jìn)一步彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測方法的不足，這些技術(shù)包括：MALDI-TOF MS、傳統(tǒng)PCR、RT-PCR、恒溫?cái)U(kuò)增、測序等。這些技術(shù)在臨床的應(yīng)用中展現(xiàn)出越來越明顯的優(yōu)勢。但目前由于其費(fèi)用因素，主要應(yīng)用于發(fā)達(dá)地區(qū)的醫(yī)療檢測機(jī)構(gòu)中，使用人群大多為富裕人群，他們對檢測質(zhì)量要求較高。而我國仍為發(fā)展中國家，大型儀器需要大量資金來維護(hù)設(shè)備以及雇用專業(yè)操作人員，偏遠(yuǎn)地區(qū)無法負(fù)擔(dān)高昂的檢測費(fèi)用，未來研發(fā)方向應(yīng)為減少大型設(shè)備依賴，普及貧困地區(qū)使用率。

表1

侵襲性真菌感染的臨床診斷仍有困難，需要結(jié)合宿主危險(xiǎn)因素、臨床表現(xiàn)、影像檢查和實(shí)驗(yàn)室檢測，結(jié)合國家指南和我國情況，可以將診斷分為確診，臨床診斷和擬診。在診斷中，就檢測技術(shù)而言，雖然各種先進(jìn)的檢測技術(shù)在不斷完善，但在臨床確診中仍需有血培養(yǎng)、無菌體液的真菌培養(yǎng)結(jié)果陽性或組織病理有陽性結(jié)果，臨床診斷需要有微生物學(xué)陽性結(jié)果，如合格痰液，支氣管肺泡灌洗液有兩次陽性發(fā)現(xiàn)，G實(shí)驗(yàn)與GM實(shí)驗(yàn)連續(xù)兩次陽性等[10]。在加大新技術(shù)應(yīng)用的同時(shí)，仍應(yīng)注重現(xiàn)有較成熟檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用。