余咸靜

(四川大學華西公共衛(wèi)生學院/四川大學華西第四醫(yī)院，四川 成都 410041)

結直腸癌是臨床常見惡性腫瘤之一，隨著人們飲食結構中動物高蛋白比重的增加，我國結直腸癌發(fā)病率呈逐年增長趨勢[1]。結直腸癌的發(fā)生可能與結腸癌細胞凋亡及組織微環(huán)境中免疫狀態(tài)有關，腫瘤微環(huán)境是一個由免疫細胞、成纖維細胞、基質(zhì)細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞等多種基質(zhì)細胞構成的綜合系統(tǒng)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體免疫系統(tǒng)密切相關，相對于外周血中免疫狀態(tài)，腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)更能準確表達機體抗腫瘤免疫反應[2-3]。所以本研究旨在檢測結直腸癌組織中癌細胞凋亡情況，T細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、樹突狀細胞(DC細胞)等免疫細胞凋亡及浸潤程度，分析結直腸癌細胞凋亡與免疫細胞凋亡及浸潤程度的關系，了解微環(huán)境免疫細胞對結直腸癌惡化的重要性，為結直腸癌治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年4月至2019年4月期間本院收集的結直腸癌組織標本92例，包括結直腸癌組織、癌旁組織(避開壞死區(qū)，距離癌結節(jié)邊緣2cm以上的結直腸組織)。男53例，女39例；年齡45～75歲，平均(58.17±6.48)歲；右半結腸癌27例，左半結腸癌35例，直腸癌30例。納入標準：①結直腸癌組織、癌旁組織標本來源于經(jīng)手術治療的患者，經(jīng)病理檢查證實為結直腸癌；②結直腸癌患者術前均未進行放化療；③組織標本的獲取和使用均獲得本院倫理委員會批準同意。排除合并其他惡性腫瘤者。

1.2 主要試劑

鼠抗人CD3單抗、鼠抗人CD56單抗、鼠抗人CD21單抗均購自北京中山生物技術有限公司；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自上海恒斐生物科技有限公司；TUNEL試劑盒購自德國羅氏公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 結直腸癌微環(huán)境免疫細胞浸潤程度的檢測

采用免疫組化SP法對T細胞、NK細胞、DC細胞進行染色。石蠟切片厚度約為4μm，37℃烤箱放置過夜，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、0.3%過氧化氫滅活、抗原修復后，加入鼠抗人CD3單抗(標記T細胞)、鼠抗人CD56單抗(標記NK細胞)或鼠抗人CD21單抗(標記DC細胞)4℃孵育12h，PBS洗滌3次后，加入生物素化標記的二抗孵育1h。PBS清洗3次后，加入辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素孵育0.5h，最后采用DAB顯色，細胞核采用蘇木精復染，脫水后封片。

T細胞計數(shù)標準：細胞膜和細胞質(zhì)被染為棕黃色者視作陽性細胞，先在100倍鏡下尋找到癌細胞密集區(qū)，然后在200倍鏡下選取25個視野，統(tǒng)計T細胞總數(shù)以表示結直腸癌微環(huán)境中T細胞浸潤程度。

NK細胞、DC細胞計數(shù)標準：細胞膜和細胞質(zhì)被染成棕黃色者視作陽性細胞，先在100倍鏡下尋找到癌細胞密集區(qū)，然后在200倍鏡下選取50個視野，統(tǒng)計細胞總數(shù)以表示結直腸癌微環(huán)境中NK細胞、DC細胞浸潤程度。

1.3.2 細胞凋亡情況的檢測

采用凋亡原位檢測試劑盒檢測凋亡細胞。石蠟切片厚度約為4μm，37℃烤箱放置過夜，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，加入蛋白酶K工作液反應20min，0.3%過氧化氫滅活10min。然后加入TUNEL反應液，在濕盒內(nèi)4℃孵育60min，再加入抗熒光素抗體，室溫下孵育30min。最后采用DAB顯色，細胞核采用蘇木精復染，脫水后封片。

凋亡細胞判斷標準：細胞核被染為棕黃色者視作陽性細胞。在100倍鏡下尋找到癌細胞密集區(qū)，在400倍鏡下選取10個視野，觀察結腸癌細胞凋亡情況。在100倍鏡下尋找到間質(zhì)內(nèi)免疫細胞聚集區(qū)，400倍鏡下選取10個視野，觀察免疫細胞凋亡情況。細胞凋亡水平以凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)評價，AI為100個細胞中陽性細胞比例[4]。由于TUNEL染色后，T細胞、NK細胞、DC細胞等免疫細胞無法區(qū)分，所以將T細胞、NK細胞、DC細胞作為整體計算腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)的AI。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Pearson分析。檢驗水準α= 0.05，均為雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 結直腸癌及癌旁組織微環(huán)境免疫細胞浸潤程度比較

結直腸癌組織T細胞、NK細胞及DC細胞浸潤程度均低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1～3(封三)。

表1 結直腸癌及癌旁組織微環(huán)境免疫細胞浸潤程度個)

2.2 結直腸癌及癌旁組織微環(huán)境細胞凋亡情況比較

結直腸癌組織TIL細胞AI高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 結直腸癌及癌旁組織微環(huán)境細胞凋亡情況指數(shù)

2.3 結直腸癌微環(huán)境中癌細胞凋亡與TIL細胞凋亡關系分析

通過表2，采用Pearson分析，得出結直腸癌細胞AI與TIL細胞AI呈負相關(r=-0.559，P<0.05)，見圖4。

圖4 結直腸癌細胞凋亡與TIL細胞凋亡的關系

2.4 結直腸癌微環(huán)境中癌細胞凋亡與免疫細胞浸潤程度關系分析

通過表1，采用Pearson分析，得出結直腸癌細胞AI與T細胞浸潤程度呈正相關(r=0.579，P<0.05)，結直腸癌細胞AI與NK細胞浸潤程度呈正相關(r=0.614，P<0.05)，結直腸癌細胞AI與DC細胞浸潤程度呈正相關(r=0.625，P<0.05),見圖5～7。

圖5 結直腸癌細胞凋亡與T細胞浸潤的關系

圖6 結直腸癌細胞凋亡與NK細胞浸潤的關系

圖7 結直腸癌細胞凋亡與DC細胞浸潤的關系

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)展與腫瘤遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)控、機體免疫功能較低等關系密切。機體免疫功能低下時，癌細胞相對活躍，可促進機體腫瘤形成，而腫瘤生長發(fā)育過程中也會反過來影響機體免疫功能，抑制免疫細胞殺傷功能，所以機體免疫功能與腫瘤細胞之間存在相互制約、互為因果的關系[5-7]。機體免疫方式包括細胞免疫和體液免疫，腫瘤形成后，細胞免疫是主要發(fā)揮抗腫瘤作用的免疫方式，體液免疫僅起到輔助作用[8]。

T細胞、NK細胞及DC細胞均參與機體細胞免疫反應。T細胞包括CD4分子和CD8分子，CD4分子結合MHCⅡ類分子后形成致敏Th1細胞，能誘發(fā)炎癥反應，CD8分子結合MHCⅠ類分子后形成細胞毒性T淋巴細胞，不僅可分泌干擾素、腫瘤壞死因子，還可與腫瘤表面抗原結合形成抗原抗體復合物，對腫瘤細胞造成特異性殺傷[9]。NK細胞屬于天然免疫細胞，是機體抗腫瘤的首要屏障，可在未刺激狀態(tài)下殺傷腫瘤細胞。NK細胞數(shù)量與機體免疫功能、抗腫瘤作用有關，許多腫瘤患者體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)NK細胞數(shù)量減少、活化受體表達量降低等現(xiàn)象[10]。DC細胞為功能最強的抗原呈遞細胞，其主要作用是將腫瘤細胞表面抗原及其代謝產(chǎn)物提呈給細胞毒性T淋巴細胞，起到殺傷腫瘤細胞作用[11]。

既往關于惡性腫瘤患者免疫功能的研究主要集中在外周血免疫細胞的變化分析，趙美淇等[12]采用流式細胞儀檢測中的T淋巴細胞及NK細胞的表達水平，對腫瘤早期發(fā)現(xiàn)和早診斷有指導意義。近些年來，人們將關注點逐漸轉(zhuǎn)移到腫瘤微環(huán)境免疫細胞與腫瘤發(fā)展的關系上。而本研究采用免疫組化、TUNEL實驗檢測結直腸癌及癌旁組織T細胞、NK細胞及DC細胞浸潤程度及TIL細胞凋亡情況，結果顯示，結直腸癌組織T細胞、NK細胞及DC細胞浸潤程度顯著低于癌旁組織，TIL細胞AI明顯高于癌旁組織(P均<0.05)，提示結直腸癌細胞可能對微環(huán)境免疫細胞具有抑制作用。為了進一步明確結直腸癌細胞與微環(huán)境免疫細胞的關系，本研究經(jīng)相關性分析結果顯示，結直腸癌細胞AI與T細胞、NK細胞及DC細胞浸潤程度均呈明顯正相關，與TIL細胞AI呈明顯負相關，提示結直腸癌細胞與微環(huán)境免疫細胞相互影響。Karki等[13]研究認為結直腸癌細胞凋亡減弱是結直腸癌發(fā)展的機制之一，并且有許多研究發(fā)現(xiàn)可通過促進結直腸癌細胞凋亡，抑制結直腸腫瘤發(fā)展[14-16]。由于細胞本身及環(huán)境因素均會對結直腸癌細胞凋亡產(chǎn)生影響，如T細胞、NK細胞可通過穿孔或Fas途徑誘導結直腸癌細胞凋亡。同時，結腸癌細胞也可通過多種機制逃避機體免疫監(jiān)控，引起免疫數(shù)量減少，DC細胞提呈腫瘤抗原能力減弱，初始T細胞活化受到抑制。Shimoyama等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與結直腸腺瘤相比，結直腸癌Fas配體陽性表達率明顯升高，認為Fas配體異常表達與結直腸癌發(fā)展有關。而有研究[18]在肝癌等其他惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，肝癌組患者基于Fas/Fasl途徑的T淋巴細胞凋亡率明顯增加，認為肝癌細胞出現(xiàn)免疫逃逸與其上調(diào)Fas配體表達引起T淋巴細胞凋亡有關。T細胞、NK細胞、DC細胞在激活后均表達Fas受體，所以推測結腸癌細胞可能會通過上調(diào)Fas配體，經(jīng)Fas/Fasl途徑誘導上述免疫細胞凋亡。

總而言之，結直腸癌微環(huán)境中免疫細胞狀態(tài)能直接反映機體抗腫瘤免疫反應，微環(huán)境免疫細胞浸潤程度、凋亡水平與結腸癌細胞凋亡水平有關，消除結直腸癌微環(huán)境中對免疫細胞的不利因素，可能會抑制結腸癌進一步惡化，這也為臨床開發(fā)免疫治療方法提供指導作用。