吳現(xiàn)磊

(濮陽(yáng)市油田總醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 濮陽(yáng) 457001)

胃癌(gastric cancer，GC)是全球第五大最常見(jiàn)的癌癥和第三大癌癥死亡原因，2018年新增病例超過(guò)100萬(wàn)，死亡人數(shù)約為78.3萬(wàn)人(相當(dāng)于全球死亡人數(shù)中每12人就有1人死于GC)[1]。GC通常在晚期才被診斷出來(lái)，此時(shí)一般已經(jīng)發(fā)生癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差，而姑息化療是主要的治療手段[2]。

在過(guò)去的幾年中，研究GC的分子生物學(xué)取得了重要進(jìn)展，GC相關(guān)的小分子被證明具有預(yù)后價(jià)值，其中長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncodingRNA，lncRNA)似乎是診斷GC最有前途的工具之一[3]。研究表明[4]，lncRNA在癌癥發(fā)展中起關(guān)鍵作用，作為促癌基因或抑癌基因參與了癌癥發(fā)展中細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等各種生物學(xué)過(guò)程。例如，ARHGAP5-AS1是在耐化學(xué)性GC細(xì)胞中上調(diào)的lncRNA，其高表達(dá)與GC患者預(yù)后差有關(guān)[5]；過(guò)表達(dá)lncRNA HOXA11-AS在體內(nèi)促進(jìn)了GC細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，提示其在GC的發(fā)生和進(jìn)展中具有致癌特性[6]。盡管已經(jīng)報(bào)道了參與GC發(fā)生和發(fā)展的幾種lncRNA，但是大多數(shù)lncRNA在GC中生物學(xué)功能和潛在機(jī)制仍有待闡明。

最近，研究[7]發(fā)現(xiàn)DSCR8在癌癥中異常表達(dá)并起到促癌基因的作用。據(jù)報(bào)道[8]，DSCR8是肝細(xì)胞癌的致癌基因，通過(guò)充當(dāng)miR-485-5p海綿來(lái)激活Wnt/β-catenin通路，從而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期；You等[7]研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞中，YY1誘導(dǎo)的DSCR8通過(guò)浸潤(rùn)miR-3192-5p上調(diào)YY1，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。這表明DSCR8可能是癌癥診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物和靶標(biāo)，然而關(guān)于DSCR8在GC中的調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。

在本研究中，我們研究了DSCR8在調(diào)節(jié)GC細(xì)胞惡性表型中的生物學(xué)作用以及可能的分子機(jī)制，通過(guò)生信分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)DSCR8與miR-107之間的調(diào)控關(guān)系。我們的研究有助于更好地了解DSCR8的致癌作用，為GC的診斷和治療提供潛在的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源

本研究中使用的細(xì)胞系信息見(jiàn)表1。人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1和GC細(xì)胞系HGC-27、NCI-N87、KATO Ⅲ、SNU-1均培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%FBS的RPMI-1640(GIBCO，貨號(hào)31800022，添加NaHCO31.5g/L，glucose 2.5g/L，sodium pyruvate 0.11g/L)中，并置于37℃，含5%CO2的條件下培養(yǎng)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

DSCR8的shRNA及相應(yīng)的陰性對(duì)照由Sengong Biotech(中國(guó)上海)合成，miR-107 inhibitor/mimic及各自的陰性對(duì)照購(gòu)自Gene Pharma(中國(guó)蘇州)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)進(jìn)行所有轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞。

1.3 qRT-PCR

使用TRIzol試劑(Invitrogen)從細(xì)胞中分離總RNA。通過(guò)Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)(Thermo ScientificTM，美國(guó))評(píng)估RNA的數(shù)量和質(zhì)量。為了評(píng)估DSCR8的表達(dá)分析，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo ScientificTM，美國(guó))將2μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對(duì)于miR-107的表達(dá)分析，使用miDETECT A TrackTMqRT-PCR試劑盒(廣州日博生物有限公司，中國(guó))將2μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green PCR試劑盒(Takara Bio，Otsu，Japan)在StepOne實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)上進(jìn)行qRT-PCR。2-ΔΔCt方法用于計(jì)算通過(guò)GAPDH和U6標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)基因表達(dá)。引物序列在表2中列出。

表2 qRT-PCR的引物序列

1.4 熒光原位雜交(FISH)

使用Ribobio合成的FISH探針進(jìn)行FISH，并根據(jù)制造商的說(shuō)明使用FISH試劑盒(RiboBio Co.，中國(guó)廣州)進(jìn)行操作。將蓋玻片上的細(xì)胞用PBS洗滌并在室溫下用4%多聚甲醛固定10min，然后在4℃下用含0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)滲透細(xì)胞5min。在添加探針之前，將細(xì)胞在雜交混合物中預(yù)雜交30min。與DSCR8-Fish Probe Mix在37℃下孵育過(guò)夜后，細(xì)胞用4×含0.1%Tween-20的檸檬酸鈉(SSC)，2×SSC和1×SSC于42℃洗滌5min，用4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染色10min。最后通過(guò)熒光顯微鏡觀察圖像。

1.5 CCK-8分析

使用Cell Counting Kit-8試劑盒(Beyotime，中國(guó)上海)檢測(cè)細(xì)胞增殖。將細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞濃度接種到96孔板中。細(xì)胞分別孵育0、24、48、72、96h后，向每個(gè)孔中加入10μL CCK-8溶液，并在37℃下再培養(yǎng)2h。用酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔在450nm(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)波長(zhǎng)處的吸光度。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后48h，將細(xì)胞(每孔1×103)接種到6孔板中，并用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2周直到明顯的克隆形成。細(xì)胞集落用4%多聚甲醛固定30min，并在室溫下用0.5%結(jié)晶紫染色30min。用無(wú)菌水清洗每個(gè)孔，去除殘留的結(jié)晶紫。將細(xì)胞數(shù)超過(guò)50個(gè)的定義為克隆，計(jì)算每孔的克隆數(shù)。

1.7 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

使用Transwell inserts(8μM pore size，Costar，Cambridge，MA，USA)進(jìn)行遷移和侵襲測(cè)定。將細(xì)胞接種到?jīng)]有或預(yù)先涂有基質(zhì)膠(BD，F(xiàn)ranklin Lakes，USA)的頂室中分別進(jìn)行遷移或侵襲分析，將600μL含10%FBS的培養(yǎng)基置于下腔室中。在37℃、5%CO2的條件下孵育24h后，用棉簽擦拭上室中未遷移或侵襲的細(xì)胞，并用甲醇固定遷移或侵襲的細(xì)胞，用0.5%結(jié)晶紫染色并用PBS洗滌。然后在顯微鏡下以200×的放大倍數(shù)計(jì)數(shù)。

1.8 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

從人基因組DNA中擴(kuò)增了DSCR8的3'-UTR序列。然后將這些序列分別亞克隆到pGL3熒光素酶報(bào)告載體(Promega，Madison，WI，USA)中。潛在的miR-107結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)Quick-change定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)突變。將DSCR8模擬物的wt(mut)3'-UTR共轉(zhuǎn)染到GC細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，通過(guò)Dual-Lucy Assay Kit(Progema，Madison，WI，USA)測(cè)量螢火蟲和海腎熒光素酶的活性熒光素酶活性。

1.9 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)

使用Magna RIP kit(Millipore，Billerica，USA)進(jìn)行RIP檢測(cè)。用DSCR8和miR-107轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并將其重懸于裂解緩沖液中。將100μL全細(xì)胞提取物與Ago2抗體(Abcam，Cambridge，UK)或IgG(Abcam，Cambridge，UK)綴合的Protein G瓊脂糖微珠在4℃孵育過(guò)夜。在室溫下用DNA酶I和蛋白酶K處理免疫沉淀物20 min?；厥展渤恋淼腞NA，并進(jìn)行qRT-PCR分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 DSCR8在GC組織的表達(dá)

通過(guò)starBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://starbase.sysu.edu.cn/)，我們發(fā)現(xiàn)DSCR8在GC組織中為高表達(dá)(圖1A，封二)。進(jìn)一步利用qRT-PCR檢測(cè)DSCR8在GC細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與GES-1細(xì)胞相比，DSCR8在GC細(xì)胞系HGC-27、KATO Ⅲ、NCI-N87和SNU-1中的表達(dá)顯著上調(diào)(圖1B，封二)。接下來(lái)，我們選擇HGC-27細(xì)胞和NCI-N87細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于lncRNA的亞細(xì)胞定位與其生物學(xué)功能和潛在的分子機(jī)制密切相關(guān)[9]。因此，我們通過(guò)RNA-FISH檢測(cè)DSCR8的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，大多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)分布在細(xì)胞核中(圖1C，封二)。

2.2 敲低DSCR8抑制GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

為了評(píng)估DSCR8在GC中的生物學(xué)作用，我們通過(guò)將sh-DSCR8轉(zhuǎn)染到HGC-27細(xì)胞和NCI-N87細(xì)胞中抑制DSCR8的表達(dá)(圖2A，封二)。通過(guò)CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞的增殖變化，結(jié)果表明敲低DSCR8能抑制細(xì)胞的增殖和集落形成(圖2B、2C，封二)。接著，我們通過(guò)Transwell檢測(cè)DSCR8的抑制對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DSCR8敲低后的細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低(圖2D，封二)。因此，敲低DSCR8抑制GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

2.3 DSCR8充當(dāng)miR-107的分子海綿

為了進(jìn)一步驗(yàn)證DSCR8在GC中的調(diào)控機(jī)制，我們通過(guò)NCBI查詢DSCR8和miR-107的核苷酸序列，然后在DNAMAN軟件上進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)DSCR8和miR-107具有互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖3A，封二)。為了證實(shí)DSCR8充當(dāng)了miR-107的分子海綿，我們首先將sh-DSCR8轉(zhuǎn)染到HGC-27和NCI-N87細(xì)胞中，檢查miR-107水平是否受sh-DSCR8影響。qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sh-DSCR8后，miR-107的表達(dá)顯著上調(diào)(圖3B，封二)。構(gòu)建了DSCR8-wt和DSCR8-mut報(bào)告載體并進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DSCR8-wt的熒光素酶活性顯著下調(diào)，含有DSCR8-mut載體的細(xì)胞其螢光素酶活性則未受影響(圖3C，封二)。RIP實(shí)驗(yàn)顯示，使用Ago2抗體進(jìn)行免疫沉淀后，miR-107和DSCR8在HGC-27和NCI-N87細(xì)胞中富集(圖3D，封二)，表明miR-107和DSCR8存在結(jié)合關(guān)系。因此，在GC中DSCR8與miR-107之間存在直接相互作用。

2.4 miR-107逆轉(zhuǎn)DSCR8對(duì)GC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生的影響

為了研究DSCR8是否通過(guò)miR-107依賴性方式調(diào)節(jié)GC細(xì)胞的惡性表型，我們將sh-NC+NC inhibitor、sh-DSCR8+NC inhibitor、sh-DSCR8+miR-107 inhibitor分別轉(zhuǎn)染到HGC-27細(xì)胞和NCI-N87細(xì)胞中，并評(píng)估了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。我們發(fā)現(xiàn)DSCR8的敲低能抑制HGC-27和NCI-N87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而miR-107 inhibitor的轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)sh-DSCR8對(duì)HGC-27和NCI-N87細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的抑制作用(圖4A～4D，封三)。因此，抑制miR-107逆轉(zhuǎn)了敲低DSCR8對(duì)GC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

3 討 論

lncRNA是近年來(lái)出現(xiàn)的最大且具有顯著多樣性的RNA家族之一[10]。隨著人類轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的發(fā)展，已鑒定出一些與GC發(fā)展相關(guān)的lncRNA，例如lncRNA MEG3[11]、lncRNA AK023391[9]、lncRNA HOXC-AS3[12]等。除了特征明確的lncRNA，在控制GC進(jìn)程中潛在的lncRNA及其相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制仍然值得研究。在本研究中，我們基于基因表達(dá)譜分析鑒定出在GC中被上調(diào)的DSCR8，并通過(guò)qRT-PCR、CCK8、克隆形成和Transwell等一系列的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究DSCR8表達(dá)量下調(diào)對(duì)GC細(xì)胞生物學(xué)功能產(chǎn)生的影響。我們發(fā)現(xiàn)DSCR8表達(dá)量的下調(diào)會(huì)對(duì)GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力產(chǎn)生抑制作用，這與其在子宮癌[13]、黑素瘤[14]和肝癌[8]的功能一致。在這些癌癥中，DSCR8可能是潛在的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)?？傊?，DSCR8在GC細(xì)胞中發(fā)揮了促癌基因的作用。

lncRNA在生物學(xué)上的作用和功能目前大部分尚不清楚。它們?cè)趍icroRNAs上的海綿功能最近幾年被發(fā)現(xiàn)后受到廣泛研究。miRNAs是一類非編碼RNA，通過(guò)作用于mRNA來(lái)調(diào)控細(xì)胞，在蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮核心作用。lncRNA可以作為miRNA海綿，降低其對(duì)mRNA的調(diào)控作用[15]。由于DSCR8很可能作為ceRNAs發(fā)揮作用，因此，在本研究中，我們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)以及RIP分析，確定了DSCR8與在GC中顯著低表達(dá)的miR-107存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，DSCR8是miR-107的分子海綿。已有研究表明[8]，DSCR8能夠靶向miR-485-5p/Wnt/catenin軸調(diào)控肝癌進(jìn)程。同時(shí)，我們也在GC細(xì)胞中通過(guò)CCK8、克隆形成、Transwell等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了低表達(dá)miR-107對(duì)DSCR8所發(fā)揮功能的抑制作用。因此，我們認(rèn)為DSCR8海綿吸附miR-107促進(jìn)了GC的發(fā)展。

總之，我們確定DSCR8在GC中作為一種癌基因在中起重要作用。我們的研究首次證實(shí)了DSCR8通過(guò)吸附miR-107促進(jìn)GC的發(fā)展。該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能為闡明GC的腫瘤發(fā)生提供線索，并可能為開(kāi)發(fā)GC的新型診斷和治療方法提供理論依據(jù)。