柳 國，李婷婷，李月生，陳洪國，吳鳴虎

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院)

智能水凝膠是一種能根據(jù)環(huán)境變化或外部刺激、體積或者其他物理化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生快速變化的特殊水凝膠[1]。三維網(wǎng)絡(luò)多孔結(jié)構(gòu)是水凝膠可通過原位裝載或后裝載的方式，利用三維網(wǎng)絡(luò)微結(jié)構(gòu)的改變來獲得藥物控制釋放[2]。當(dāng)病變部位的溫度、pH值、磁場等外部環(huán)境信息發(fā)生變化后，智能水凝膠可在病灶部位產(chǎn)生特別的刺激應(yīng)答，發(fā)生相應(yīng)的物理-化學(xué)性質(zhì)變化。因此，智能水凝膠在藥物載體領(lǐng)域的研究和應(yīng)用日益受到關(guān)注[3]。

對(duì)單一刺激敏感水凝膠的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，但大多數(shù)水凝膠不能在接收到某種環(huán)境刺激時(shí)產(chǎn)生瞬間和顯著的響應(yīng)。因此，制備多重敏感水凝膠藥物載體是解決上述問題的理想方法。溫度和pH值是體內(nèi)重要的環(huán)境因素，并且一些疾病往往伴隨著溫度或pH值的變化[4]。Zhan等[5]制備了同時(shí)具有多重響應(yīng)性的聚(N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)納米水凝膠藥物載體，在病變部位具有良好的緩釋效果。在水凝膠結(jié)構(gòu)中引入均勻分散的納米粒子可以作為物理填料吸收裂紋擴(kuò)展釋放的能量，達(dá)到提高水凝膠機(jī)械強(qiáng)度的目的；同時(shí)一些具有磁性的納米粒子的引入還可能賦予水凝膠新的性能。

傳統(tǒng)的水凝膠合成工藝需要添加引發(fā)劑和催化劑等，導(dǎo)致聚合產(chǎn)物的純度低，聚合反應(yīng)過程較慢、效率低，聚合反應(yīng)可控性低，合成過程易產(chǎn)生污染物等缺點(diǎn)[6]。相比之下，輻射技術(shù)制備的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在：輻射合成方法簡單，無相關(guān)物質(zhì)殘留；常溫下即可反應(yīng)；聚合反應(yīng)程度易于控制；反應(yīng)得到的聚合物分子質(zhì)量及其分布更易控制等[7]。

我們以NIPAAm/HHPC/Fe3O4(NHF)三元復(fù)合水凝膠為藥物載體材料，BSA為模型藥物，構(gòu)建一種智能水凝膠給藥系統(tǒng)，水凝膠的多孔結(jié)構(gòu)及其官能團(tuán)等可以通過靜電作用力、疏水作用力、氫鍵等吸附BSA，利用熒光分光光度計(jì)等手段驗(yàn)證了復(fù)合水凝膠對(duì)BSA的吸附機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)購自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司，高取代羥丙基纖維素(H-HPC)購自濟(jì)南金輝化工有限公司，牛血清白蛋白(BSA)購自上海瑞永生物科技有限公司，氯化鉀(KCl)AR購自上海麥克林生化科技有限公司，氯化鈉(NaCl)AR、磷酸二氫鉀(KH2PO4)AR、十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) AR、磷酸氫二鉀(K2HPO4)AR均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器

電子束加速器(1MeV電壓1000kv)購自美國wasik公司，真空包裝機(jī) (DZ-400B)購自上海嘉賽，真空干燥箱(DZF-6030)、恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9030A)購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，精密增力電動(dòng)攪拌器(JJ-1)購自江蘇金壇市城東新瑞儀器廠，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (DF-101S)購自鞏義予華儀器有限責(zé)任公司，熒光分光光度計(jì)(F96PRO)購自上海棱光科技有限公司，電子天平(HX502T)購自慈溪市天東衡器廠。

1.2 NHF三元復(fù)合水凝膠的輻射制備

稱取質(zhì)量為10g的N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)單體于三口燒瓶中，向燒瓶中加入100g去離子水，超聲處理約10min待單體完全混合均勻后，常溫下磁石攪拌(轉(zhuǎn)速350r/min)，并連續(xù)通氮?dú)?0min，保證無氧條件下，用注射器將其注入聚乙烯袋(200mm×150mm)中并用真空包裝機(jī)密封。利用1MeV電子束加速器，在室溫下用電子束輻照單體溶液，輻照總劑量為25kGy，劑量率5kGy/pass，即可得到質(zhì)量濃度為10%的PNIPAAm預(yù)聚體。稱取質(zhì)量為10g高取代羥丙基纖維素(HHPC)溶解在100g的去離子水中，于200mL燒杯中用電動(dòng)攪拌器機(jī)械攪拌至完全溶解后，用聚乙烯膜密封燒杯口，靜置去除氣泡，即可得到質(zhì)量濃度為10%的HHPC溶液。將一定量Fe3O4加入到5.0mL去離子水中形成乳化液。將10%的NIPAAm預(yù)聚物溶液與10%的HHPC溶液以及Fe3O4乳化液按照一定比例混合，充分混合后加入到90mm培養(yǎng)皿中，鋪盤得到3mm厚的膜，空白樣品加入相同量的水，在室溫下用電子束輻照(50kGy，5kGy/pass)，即可得到NHF水凝膠三元復(fù)合水凝膠。

1.3 吸附實(shí)驗(yàn)

1.3.1 NHF水凝膠在不同pH條件下對(duì)BSA的吸附實(shí)驗(yàn)

用熒光分光光度計(jì)測量NHF水凝膠的體外載藥性能，將緩沖液用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)至pH分別為3.0、4.0、5.0、7.4、8.0、9.0。用不同pH值的緩沖液配制3×10-5mol/L的BSA溶液，分別取20mL BSA溶液于小燒杯中，然后將烘干后的水凝膠浸泡其中，整體密封并置于冰箱中冷藏1d，待吸附飽和后，用熒光分光光度計(jì)分別測量水凝膠樣品在不同pH溶液飽和吸附后，BSA母液的熒光值，每次平行測量3次，結(jié)果取平均值，并繪制藥物負(fù)載曲線。

1.3.2 NHF水凝膠在不同溫度下對(duì)BSA的吸附實(shí)驗(yàn)

用熒光分光光度計(jì)測量NHF水凝膠的體外載藥性能，將BSA溶解于具有最佳吸附量的緩沖液中，并配制成3×10-5mol/L的BSA溶液。分別取20mL BSA溶液于標(biāo)號(hào)為1～5的四個(gè)小燒杯中，將烘干后的水凝膠分別浸泡在室溫20℃、25℃，水凝膠相變溫度(LCST)32℃，人體正常體溫37℃、42℃的溶液中，靜置12h，待吸附飽和后，用熒光分光光度計(jì)測量BSA母液的熒光值，每次平行測量三次，結(jié)果取平均值，并繪制藥物負(fù)載曲線。

1.3.3 NHF水凝膠在不同外加磁場強(qiáng)度下對(duì)BSA的吸附實(shí)驗(yàn)

用熒光分光光度計(jì)測量NHF水凝膠的體外載藥性能。用PBS緩沖液配制3×10-5mol/L的BSA溶液，分別取20mL BSA溶液于小燒杯中，通過控制外加磁鐵的數(shù)量(1～5)，使得外加磁場強(qiáng)度分別為：1MF、2MF、3MF、4MF、5MF，然后將烘干后的水凝膠浸泡其中并將其置于不同外加磁場強(qiáng)度下，整體密封并置于冰箱中冷藏1d，待吸附飽和后，用熒光分光光度計(jì)測量BSA母液的熒光值，每次平行測量3次，結(jié)果取平均值，并繪制藥物負(fù)載曲線。

2 結(jié) 果

2.1 NHF水凝膠在不同pH條件下對(duì)BSA的吸附行為

從圖1可以看出，飽和吸附后的BSA母液的熒光值大小順序?yàn)椋簆H=9.0>pH=8.0>pH=4.0>pH=5.0>pH=3.0>pH=7.4>control。pH=3.0時(shí)，BSA在溶液中的疏水性最小，水凝膠與BSA分子之間主要存在疏水作用力，兩者之間的疏水作用力最小[8]，有利于水凝膠對(duì)BSA的吸附。因此，BSA在pH=3.0時(shí)的熒光值較低。pH=4.0～5.0時(shí)，此時(shí)pH值接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，BSA聚集程度較高[8]，容易團(tuán)聚，體積較大，不利于在水凝膠中自由進(jìn)出。當(dāng)pH=5.0時(shí)，BSA團(tuán)聚程度大，BSA被水凝膠吸附后不容易從它的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中游離出來。pH=7.4時(shí)pH值大于等電點(diǎn)，破壞了BSA分子內(nèi)部的親水-疏水平衡,導(dǎo)致疏水性核的包埋和分子的變性，而且此時(shí)BSA在溶液中的疏水作用力最強(qiáng)[8]。水凝膠中的N-異丙基為疏水基團(tuán)，兩者之間的疏水作用力最大，此時(shí)水凝膠更傾向于發(fā)生吸水溶脹，使得母液中BSA濃度較高。pH=8.0～9.0時(shí)，BSA在溶液中的疏水作用力相同，但此時(shí)水凝膠-COOH被電離成-COO-。隨著溶液pH值的增加，水凝膠內(nèi)部孔徑在靜電排斥力作用下逐漸變大，BSA表面的負(fù)電荷也逐漸增加[8]。水凝膠對(duì)BSA的靜電排斥也更強(qiáng)，水凝膠吸附的BSA逐漸減少。

圖1 NHF水凝膠在不同pH值下吸附BSA后溶液的熒光值

2.2 NHF水凝膠在不同溫度下對(duì)BSA的吸附行為

由圖2可知，隨著溫度升高，水凝膠對(duì)BSA的吸附呈下降趨勢，主要原因是：PNIPAM的分子結(jié)構(gòu)里同時(shí)含有疏水性的異丙基和親水性的酰胺基團(tuán)。溫敏型的PNIPAM的LCST為32℃，生理溫度為37℃，故而將溫度設(shè)置在20℃～42℃進(jìn)行討論。在TLCST時(shí)，整個(gè)PNIPAM由疏水性的異丙基基團(tuán)主導(dǎo)，酰胺基團(tuán)與H2O分子之間的氫鍵發(fā)生斷裂，水凝膠溶脹很小。在溫度為40℃時(shí)，NHF水凝膠的內(nèi)部骨架無法舒展開來，水凝膠幾乎無法溶脹[9]，因此，吸附BSA的能力也相應(yīng)較低。

圖2 NHF水凝膠在不同溫度下負(fù)載BSA前后溶液的熒光值差

2.3 NHF水凝膠在不同外加磁場下對(duì)BSA吸附性能

由圖3可知，對(duì)照組(a)與實(shí)驗(yàn)組(b、c、d、e、f、g)相比，加入NHF水凝膠后，實(shí)驗(yàn)組在對(duì)BSA飽和吸附后的母液的熒光值均比對(duì)照組濃度大，這是水凝膠親水性比較強(qiáng)，優(yōu)先吸附水分子，進(jìn)而導(dǎo)致溶液溶度變高的原因。由于實(shí)驗(yàn)組(c、d、e、f、g)中引入了外加磁場，水凝膠樣品對(duì)BSA飽和吸附后母液的熒光值變低，可能原因是：磁性水凝膠中的Fe3O4納米粒子被磁化并相互吸引，從而減小了水凝膠的體積，壓縮了三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，降低了孔隙率。從而引起水凝膠對(duì)BSA的吸附量減少[10]。另一方面，隨著外加磁場強(qiáng)度(MF)越來越大，溶液的熒光值也變越來越大。主要原因是水凝膠中的磁性功能粒子被磁化，在磁場作用下，納米Fe3O4載體會(huì)振蕩而起到泵的作用效應(yīng)越來越強(qiáng)，不利于BSA的吸附。因此，外加磁場強(qiáng)度越大，越不利于水凝膠對(duì)BSA的吸附。

圖3 NHF水凝膠在不同外加磁場下對(duì)BSA的吸附性能

3 討 論

以NIPAAm、HHPC、Fe3O4為主要基材，利用電子束預(yù)輻射法成功制備了NIPAAm/HHPC/Fe3O4(NHF)三元協(xié)調(diào)響應(yīng)的智能水凝膠。重點(diǎn)評(píng)價(jià)了NHF水凝膠在不同的pH、溫度、磁場條件下，對(duì)模擬藥物BSA的吸附行為及其機(jī)制。結(jié)果表明：NHF水凝膠對(duì)BSA可能的吸附機(jī)制被提出。由于pH的不同，靜電排斥力、疏水作用力等會(huì)引起水凝膠與BSA分子之間的相互作用機(jī)制不同。此外，溫度的差異也會(huì)導(dǎo)致水凝膠骨架的伸展與收縮，引起水凝膠對(duì)BSA飽和吸附量的變化。當(dāng)然，外加磁場強(qiáng)度越大，越不利于水凝膠對(duì)BSA的吸附。因此，NHF水凝膠可以通過溫度、pH、磁三元協(xié)同調(diào)控藥物的吸附與釋放，這一特性有望在醫(yī)用藥物控釋與給藥遞送系統(tǒng)等方面得到應(yīng)用。