羅 純，章 群，黃志基，張玉寧

（暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系，廣州 510632）

中國(guó)與日本海域相連，是南北暖冷魚(yú)類(lèi)的重要交匯區(qū)。一方面，由于同源擴(kuò)散的結(jié)果，兩國(guó)沿海部分魚(yú)類(lèi)特別是近海種類(lèi)呈現(xiàn)高度相似性；另一方面，由于地理環(huán)境有所區(qū)別，再經(jīng)過(guò)歷史演替，兩國(guó)沿海魚(yú)類(lèi)在共性的基礎(chǔ)上也呈現(xiàn)一定差異［1］。近年來(lái)，隨著中國(guó)沿海經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，海洋漁業(yè)資源被過(guò)度利用，漁獲物低齡化現(xiàn)象嚴(yán)重［2］，對(duì)海洋魚(yú)類(lèi)資源開(kāi)展深入研究有助于漁業(yè)的長(zhǎng)期、可持續(xù)性發(fā)展。

為了有效保護(hù)和管理魚(yú)類(lèi)資源，對(duì)魚(yú)類(lèi)進(jìn)行鑒定分類(lèi)必不可少。由于傳統(tǒng)分類(lèi)基于外部形態(tài)特征，對(duì)分類(lèi)者的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)要求較高，同時(shí)有些物種形態(tài)結(jié)構(gòu)易受到地理環(huán)境和不同發(fā)育階段的影響；還有部分魚(yú)類(lèi)存在雌雄轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，具有性別二態(tài)性［3］：如隆頭魚(yú)科魚(yú)類(lèi)為世界性分布，多數(shù)種存在幼魚(yú)期、成魚(yú)期及超雄期之間以及雌雄之間的體色和形態(tài)的差異［4］，給物種分類(lèi)鑒定造成了一定困難。

DNA條形碼不僅可以識(shí)別整條魚(yú)，還可以識(shí)別魚(yú)片、魚(yú)鰭和其他難以根據(jù)形態(tài)學(xué)識(shí)別的魚(yú)體碎片［5］。2005年WARD等［6］利用COI基因?qū)Π拇罄麃?07種魚(yú)類(lèi)進(jìn)行鑒定，表明COI基因能夠有效區(qū)分不同物種。動(dòng)物線粒體COI基因5′端約650 bp序列已被公認(rèn)為是有效區(qū)分不同物種的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域［7-8］。大量研究也表明，線粒體DNA條形碼技術(shù)在解決同種異名、異種同名、發(fā)掘隱藏種方面較傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)具有顯著優(yōu)勢(shì)。

目前，對(duì)中日沿海魚(yú)類(lèi)的研究報(bào)道多為生態(tài)資源調(diào)查［1］、遺傳結(jié)構(gòu)與分子系統(tǒng)地理學(xué)研究［9-11］等。在分類(lèi)方面，日本學(xué)者河野光久等［12］對(duì)日本海西南部山口縣的魚(yú)類(lèi)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)研究，共確認(rèn)了39目197科870種?；囊?jiàn)真一郎等［13］運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)鑒定了神奈川縣市場(chǎng)31種魚(yú)類(lèi)。李昂等［14］對(duì)中國(guó)近海和日本近海的白姑魚(yú)分類(lèi)地位和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了研究。本研究測(cè)定了在日本沿海采集的37種魚(yú)類(lèi)的184條COI基因序列，并結(jié)合GenBank下載的序列，共分析了中日沿海共有種327條COI基因序列，以期確定日本及中國(guó)沿海魚(yú)類(lèi)的分類(lèi)地位，為相關(guān)海域魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源保護(hù)和可持續(xù)利用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及分子實(shí)驗(yàn)

研究樣品于2018年4月—2019年7月采集于日本太平洋側(cè)瀨戶內(nèi)海明石沖（34°38′41″N、134°59′23″E）和日本海側(cè)若狹灣舞鶴（35°27′01″N、135°18′52″E）等地，并置于95% 乙醇中保存。依據(jù)Fishbase數(shù)據(jù)庫(kù)，并參照《中國(guó)魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)檢索》［15］、《黃渤海魚(yú)類(lèi)圖志》［16］等資料進(jìn)行形態(tài)鑒定，測(cè)序標(biāo)本和下載序列信息見(jiàn)表1。

取0.2 g魚(yú)尾鰭肌肉晾干后，參考樂(lè)小亮［17］改進(jìn)的苯酚／氯仿法提取DNA。參考WARD［18］方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。使用引物FishF1：5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′，F(xiàn)ishR1：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′，反應(yīng)體系為20μL：上下游引物各1μL，PCR Mix 10 μL，DNA模板1μL，ddH2O 7μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至北京六合華大基因公司正向測(cè)序。

1.2 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Bioedit 7.0.9.0［19］軟件上對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行人工校對(duì)。運(yùn)用MEGA 7.0［20］軟件分析序列特征，計(jì)算堿基組成、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、單一可變位點(diǎn)等分子多樣性指數(shù)；基于Kimura 2-parameter（K2P）替代模型，分別計(jì)算種內(nèi)、屬內(nèi)種間、屬內(nèi)、科內(nèi)屬間遺傳距離，經(jīng)1 000次重復(fù)抽樣（bootstraps）檢測(cè)分支置信度構(gòu)建鄰接（neighbor-joining）樹(shù)。采用自動(dòng)條形碼間隙檢索方法 （automatic barcode gap discovery，ABGD）［21］將全部序列自動(dòng)分組進(jìn)行假設(shè)種分析，同時(shí)利用種內(nèi)遺傳距離及種間遺傳距離繪制條形碼間隙圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因序列特征

參照國(guó)際上通用的DNA條形碼長(zhǎng)度，截取平均長(zhǎng)度為638 bp（552 bp ～652 bp）的5′端COI序列進(jìn)行分析［22］。在本研究測(cè)定序列和GenBank下載的7目24科35屬40種327條序列中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)堿基插入和缺失現(xiàn)象。共檢測(cè)到315個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有308個(gè)，單一可變位點(diǎn)有7個(gè)。堿基T、C、A、G的平均含量分別為29.4%、28.5%、23.2%、18.8%，A+T含量（52.7%）高于G+C含量（47.3%），表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性，該結(jié)果與動(dòng)物COI基因堿基組成中普遍存在的AT含量高于GC含量的特征一致［18］。

2.2 各階元平均遺傳距離概況

各分類(lèi)階元的K2P遺傳距離如表2和圖1所示。40種魚(yú)類(lèi)種內(nèi)遺傳距離為0～3.91%，平均遺傳距離為0.42%；屬內(nèi)種間遺傳距離為0.32%～17.64%，平均遺傳距離為6.25%；屬內(nèi)種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的14.88倍，符合HEBERT［22］提出的物種鑒別“十倍法則”，即種間遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離的10倍以上。圖1顯示：種內(nèi)遺傳距離98%集中在0～2%區(qū)間；屬內(nèi)種間遺傳距離集中在2%～18%區(qū)間內(nèi)，二者形成了明顯的條形碼間隙。

2.3 條形碼分子系統(tǒng)樹(shù)分析

從圖2鄰接樹(shù)看，327條序列形成了41分支，平均遺傳距離分支間21.81%（1.97% ～28.29%）是分支內(nèi)0.30%（0～0.81%）的73倍（圖3），40種魚(yú)類(lèi)有36種形成了單系分支，支持其物種有效性。白姑魚(yú)（Pennahia argentata）形成2個(gè)分支，中國(guó)和日本全部個(gè)體各自聚類(lèi)成一支，分支間遺傳距離為3.28%?；|（Lateolabraxspp.）形成2個(gè)自展支持率為100%的分支，日本和中國(guó)個(gè)體分別成支，分支間遺傳距離為6.98%。赫氏高眼鰈（Cleisthenes herzensteini）和松木高眼鰈（C.pinetorum）混雜分布在同一分支上，分支內(nèi)的遺傳距離為0.23%。在ABGD分析中（圖4），當(dāng)種內(nèi)先驗(yàn)遺傳距離P為0.021 5% 時(shí)，40種魚(yú)類(lèi)被劃分為40個(gè)假設(shè)種。瓦氏（Callionymus valenciennei）和飾鰭斜棘（Repomucenus ornatipinnis）被歸為一個(gè)假設(shè)種，其余種的劃分與鄰接樹(shù)形成的分支相一致。

·續(xù)表1·

表2 不同分類(lèi)階元的遺傳距離Tab.2 Genetic distance summary of different categories

圖1 不同分類(lèi)階元的遺傳距離圖Fig.1 Distribution chart of genetic distance for 40 species based on the K 2P model

本研究采取同一物種內(nèi)多個(gè)個(gè)體比較分析的策略，計(jì)算每一種魚(yú)類(lèi)種內(nèi)不同樣本間的遺傳距離，結(jié)合各種間遺傳距離繪制40種魚(yú)類(lèi)條形碼間隙圖，以獲得種內(nèi)與種間遺傳距離的差異度。圖5顯示松木高眼鰈（9）和赫氏高眼鰈（10）最大種內(nèi)遺傳距離未能與最小種間遺傳距離很好的分離，其余98%的魚(yú)類(lèi)均能夠形成良好的條形碼間隙。

3 討論

3.1 花鱸與白姑魚(yú)分類(lèi)地位的探討

YOKOGAWAL等［23］研究發(fā)現(xiàn)，日本花鱸（L.japonicus）和中國(guó)花鱸（L.maculatus）在形態(tài)和遺傳上具有顯著差異，前者側(cè)線鱗片數(shù)76 ～92，鰓耙數(shù)24 ～30，后者側(cè)線鱗片數(shù)66 ～82，鰓耙數(shù)19 ～24；且基于同工酶等位基因頻率計(jì)算的遺傳距離為0.174，應(yīng)為2個(gè)不同的物種。中山耕至［24］研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)花鱸和日本花鱸細(xì)胞色素類(lèi)型與分布不同。更新世冰期海平面下降，日本海和中國(guó)東海成為2個(gè)獨(dú)立的避難所，使分布其中的鱸魚(yú)逐漸分化［25］。在本研究中，花鱸種內(nèi)平均遺傳距離為3.91%，大于2%的物種遺傳閾值；在鄰接樹(shù)上形成中國(guó)群體和日本群體2個(gè)分支，分別對(duì)應(yīng)于中國(guó)花鱸和日本花鱸，分支間平均遺傳距離（6.98%）是分支內(nèi)平均遺傳距離（0.49%）的14.2倍，符合“10倍法則”；支持將二者作為2個(gè)物種的分類(lèi)處理。

在鄰接樹(shù)上，中國(guó)和日本白姑魚(yú)各自獨(dú)立成支，平均遺傳距離分支間（3.28%）是分支內(nèi)（0.29%）的11.3倍；ABGD也將白姑魚(yú)分為2組。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從生物學(xué)特性等方面對(duì)其進(jìn)行了研究，韓志強(qiáng)等［26-27］通過(guò)白姑魚(yú)線粒體DNA控制區(qū)和Cytb基因序列和AFLP技術(shù)對(duì)白姑魚(yú)系統(tǒng)地理分布模式的研究，表明中日白姑魚(yú)組群遺傳分化顯著；李昂［28］通過(guò)對(duì)中日白姑魚(yú)的耳石形態(tài)和線粒體基因組全序列分析發(fā)現(xiàn)，二者存在一定程度的分化，認(rèn)為邊緣海的隔離是造成白姑魚(yú)分化的原因，海洋洋流、海水溫度以及東海深海溝是維持當(dāng)前分化的主要因素［27］。本研究中，根據(jù)物種鑒定的種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的10倍和種內(nèi)遺傳距離一般小于2%法則，推測(cè)中國(guó)沿海和日本的白姑魚(yú)是兩個(gè)亞種乃至不同種。

圖2 基于線粒體COI基因序列的40種魚(yú)類(lèi)鄰接樹(shù)Fig.2 Neighbor-joining tree based on m tDNA COI sequences of 40 fish species

圖3 41個(gè)分支的分支內(nèi)（左）和分支間（右）遺傳距離Fig.3 Genetic distance w ithin（left）and among（right）41 clades

圖4 中日沿海部分魚(yú)類(lèi)的ABGD分析圖Fig.4 Automatic barcode gap discovery analysis of some coastal fishes in China and Japan

3.2 高眼鰈屬分類(lèi)地位的探討

赫氏高眼鰈和松木高眼鰈混雜在遺傳距離為0.23%的分支內(nèi)，種間平均遺傳距離（0.32%）和種內(nèi)遺傳距離（0.23%），均在一般物種的種內(nèi)遺傳范圍內(nèi)。由于沒(méi)有赫氏高眼鰈的憑證標(biāo)本，推測(cè)可能存在鑒定錯(cuò)誤的情況，但不排除存在譜系揀選尚未完成的可能性。

3.3 瓦氏與飾鰭斜棘分類(lèi)地位的探討

圖5 40種魚(yú)類(lèi)DNA條形碼間隙圖Fig.5 DNA barcoding gap for 40 fish species

3.4 花鰭海豬魚(yú)的分類(lèi)探討

本研究中，花鰭海豬魚(yú)形態(tài)差異較大，其種內(nèi)平均遺傳距離為0.56%，且能形成單系分支?；捄Ｘi魚(yú)幼體表現(xiàn)為雌性，成體后轉(zhuǎn)換為雄性，且雌雄個(gè)體之間存在體色和形態(tài)的差異［33-34］，易被誤認(rèn)為不同的物種。福井行雄等［35］研究發(fā)現(xiàn)，雌性個(gè)體體色偏黃，體側(cè)中央有一細(xì)的明顯褐色縱帶，自吻端經(jīng)眼徑直達(dá)尾鰭基，此縱帶在胸鰭上方及尾鰭基處黑色加深；而雄性個(gè)體在胸鰭基底后方上具一大黑斑，且背鰭、臀鰭和尾鰭有紅色斑紋。而本研究中花鰭海豬魚(yú)的形態(tài)差異就是雌雄個(gè)體的差異。事實(shí)上，大部分隆頭科魚(yú)類(lèi)存在性別二態(tài)性，了解雌雄之間的差異對(duì)于種類(lèi)鑒定、形態(tài)研究以及判斷雌、雄在繁殖過(guò)程中的不同角色有著重要的意義。

綜上所述，基于COI基因的DNA條形碼技術(shù)能夠?qū)θ毡敬蟛糠趾Ｑ篝~(yú)類(lèi)進(jìn)行有效的區(qū)分，說(shuō)明線粒體COI基因作為日本海洋魚(yú)類(lèi)DNA條形碼適用性廣，對(duì)于目前研究尚不深入的非經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，尤其是易引起誤鑒的雌雄異形的魚(yú)類(lèi)，展開(kāi)線粒體COI基因的研究工作尤為重要。本研究中，由于西北太平洋獨(dú)特的地理構(gòu)造和復(fù)雜的洋流體系，分布于中日沿海的魚(yú)類(lèi)呈現(xiàn)多樣的分布格局。對(duì)于中日海洋魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō)，絕大多數(shù)種類(lèi)并沒(méi)有顯著的遺傳分化，這可能與黑潮和親潮的輸送作用有關(guān)。而中日白姑魚(yú)達(dá)到亞種乃至2個(gè)不同種的水平、日本花鱸和中國(guó)花鱸間的遺傳分化，應(yīng)是與具體類(lèi)群的獨(dú)特生理生態(tài)習(xí)性和邊緣海的隔離有關(guān)。由于可參考的魚(yú)類(lèi)檢索工具書(shū)的欠缺，樣品的地理分布廣泛，難以獲得不同區(qū)域樣品進(jìn)行近緣種的比較，導(dǎo)致存在物種分類(lèi)鑒定錯(cuò)誤的可能，如松木高眼鰈和赫氏高眼鰈可能因錯(cuò)誤鑒定而出現(xiàn)聚在同一分支上的情況。另外，母系遺傳的線粒體COI基因不能反映雙親遺傳的核基因信息，難以區(qū)分物種的雜交滲透狀況。因此，準(zhǔn)確的物種鑒定不僅需要DNA條形碼進(jìn)行輔助研究，在今后的工作中仍需補(bǔ)充其同屬其他物種，同時(shí)結(jié)合形態(tài)測(cè)量、核基因標(biāo)記以及生物學(xué)研究，以進(jìn)一步明確日本與中國(guó)海洋魚(yú)類(lèi)的分類(lèi)地位。