李枝敏，王 元，房文紅，周俊芳，李新蒼

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，國家水生動物病原庫，上海 201306）

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，簡稱EHP），屬微孢子蟲目（Microsporidia），微孢子蟲科（Nosematidae），腸胞蟲屬，是一種主要寄生在對蝦肝胰腺細胞中的單細胞真核生物。EHP最早于2004 年在泰國斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）肝胰腺細胞內(nèi)被檢測到［1］，直到2009年TOURTIP等［2］才將其正式命名為蝦肝腸孢蟲，并將其認定為腸上皮細胞微孢子蟲屬的一個新種。隨后，國內(nèi)外均對EHP開展了大量的研究，研究內(nèi)容涉及EHP檢測方法、流行病學(xué)、典型臨床癥狀和病理變化等［3-13］，如目前已建立對蝦EHP的LAMP檢測方法［3-4］和TaqMan熒光定量PCR檢測方法［5-6］，均可用于病原的快速檢測；流行病學(xué)研究顯示，EHP主要通過水平方式進行傳播，但也有研究人員發(fā)現(xiàn)該病原也可以通過垂直方式傳播［7-11］；前期大量研究表明，EHP感染對蝦的典型臨床癥狀為生長緩慢或停滯，有時出現(xiàn)白便癥狀，但對蝦的存活率沒有顯著改變［9，11］。綜合已有文獻發(fā)現(xiàn)，目前對EHP的生物學(xué)特性還缺乏足夠了解，關(guān)于該病原的一些重要科學(xué)問題，如在國內(nèi)暴發(fā)流行的EHP與國外流行株是否屬于同一個種，該病原在世界流行暴發(fā)是否會導(dǎo)致某些基因產(chǎn)生變異等，尚無明確報道。此外，EHP侵染的分子機制仍不清楚。因此有必要鑒定一批可能與EHP侵染相關(guān)的分子，開展前期基礎(chǔ)研究，為EHP侵染機制乃至疾病防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

孢壁蛋白位于微孢子蟲孢子的最外層，研究表明某些孢壁蛋白能與宿主細胞表面組分直接接觸，參與侵染過程。例如，家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）的特定孢壁蛋白在其侵染宿主的過程中發(fā)揮了重要的作用［14-15］，提示EHP的某些孢壁蛋白也可能參與了宿主的侵染過程。因此，鑒定EHP孢壁蛋白種類，明確哪些孢壁蛋白在微孢子蟲感染過程中發(fā)揮了作用，不但可以了解微孢子蟲的感染機制，還可以將其作為阻斷感染的靶標(biāo)分子，用于開發(fā)微孢子蟲感染阻斷試劑或藥物。當(dāng)前，對EHP孢壁蛋白的報道較少，JAROENLAK等［16］在2018年報道了EHP的第1個孢壁蛋白EhSWP1，推測其可能參與EHP感染；寧梓健等［17］在2020年也預(yù)測到1個含有信號肽序列的孢壁蛋白基因SWP7，但該基因表達特點還不清楚。為進一步了解EHP孢壁蛋白的特性，本研究擬對從EHP感染陽性對蝦中獲得的4個假設(shè)孢壁蛋白基因進行鑒定，分析它們的序列特征，并比較它們的相似性及表達規(guī)律，以期促進EHP孢壁蛋白生物學(xué)特性的解析，為EHP疾病防控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

疑似發(fā)病凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei，以下簡稱對蝦）于2017年8月份取自上海青浦某對蝦養(yǎng)殖場。隨機采集外觀健康的成年活體對蝦樣本（70日齡以上）28只，對蝦體質(zhì)量為4～16 g，其中16只用于蝦肝腸孢蟲PCR檢測，6只用于孢壁蛋白基因轉(zhuǎn)錄組建庫，6只用于孢壁蛋白基因表達分析研究。

1.2 疑似EHP感染對蝦肝胰腺組織的鏡檢

為檢測該批對蝦是否存在EHP感染，取疑似EHP感染對蝦肝胰腺制作濕涂片，隨后用光學(xué)顯微鏡（LEICA，DM4B）鏡檢觀察。

1.3 組織核酸樣品提?。―NA和總RNA）

對蝦肝胰腺組織DNA的提取方法參照海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）的說明書。對蝦肝胰腺、胃、鰓和腸4個組織的總RNA選用Trizol試劑（大連TaKaRa）進行提取。提取的核酸樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA樣品符合實驗要求后，再用超微量分光光度計（ND 5000，北京百泰克）測定核酸樣品濃度，保存至-20℃條件下備用。

1.4 對蝦EHP的PCR檢測

本研究通過PCR檢測技術(shù)進一步確認對蝦樣品的EHP感染狀況，檢測方法參照前期文獻報道［16］。PCR反應(yīng)采用的引物序列為EHPF1（5′-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT-3′）和 EHPR1（5′-CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-3′），模板為1.3中提取的肝胰腺組織DNA。反應(yīng)體系如下（20 μL）：2 × Premix ExTaq10 μL，10 pmol·μL-1上下游引物（EHPF1和EHPR1）各1 μL，肝胰腺樣品DNA模板1μL（1μg·μL-1），雙蒸水7μL；PCR反應(yīng)反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；30個循環(huán)包括94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，確定陽性樣品（陽性樣品出現(xiàn)大小為514 bp的條帶）。

由圖可見，水泥凈漿流動度隨VAc加入量增加先增大后減??；而混凝土的倒坍流空時間隨著VAc的量增加迅速減少，當(dāng)VAc的加入量占單體總質(zhì)量的10%，流空時間最少，混凝土的粘度較低，隨著疏水單體VAc的加入，表面活性效果有所增強，從而降低了混凝土的粘度。而之后繼續(xù)增加VAc用量粘度卻增大，這是由于在該反應(yīng)體系中，VAc的反應(yīng)活性明顯低于其他單體，當(dāng)過量時，反應(yīng)體系活性較低、轉(zhuǎn)化率降低，有大量的單體殘余在體系中，對水泥凈漿和混凝土粘度產(chǎn)生不利影響。

1.5 cDNA的合成

通過分析對蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，獲得4個預(yù)測結(jié)果為孢壁蛋白的基因。為驗證這4個基因序列拼接的正確性，依據(jù)獲得的cDNA序列，設(shè)計4對特異性引物（表1），以cDNA為模板進行PCR擴增，獲取4個基因的開放閱讀框（ORF）序列。為獲得4個基因?qū)?yīng)的DNA序列，選取肝胰腺組織DNA為模板，并利用上述4對引物進行PCR擴增。反應(yīng)體系為：2×Premix ExTaq25 μL，10 pmol·μL-1上下游引物（EF和ER）各2 μL，cDNA模板／DNA模板2μL（1μg·μL-1），雙蒸水19μL，總體積50μL。PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5 min；35個擴增循環(huán)（94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min）；最后72℃延伸10 min。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測序及孢壁蛋白基因預(yù)測

將EHP感染中后期的對蝦肝胰腺組織總RNA送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。核酸樣品經(jīng)高通量測序后，使用Trinity序列拼接軟件將經(jīng)雙端測序的序列進行拼接，獲取轉(zhuǎn)錄本和最終的Unigenes。將Unigenes與在線數(shù)據(jù)庫（NR、SWISSPROT和KOG）進行比對并注釋，篩選EHP孢壁蛋白基因。

1.7 EHP 4個孢壁蛋白基因開放閱讀框序列及相應(yīng)DNA序列的獲取

將1.3中提取的4個組織總RNA作為模板，參照cDNA合成試劑盒（大連TaKaRa）所述方法分別進行第一鏈cDNA合成，反應(yīng)產(chǎn)物保存至-20℃條件下備用。

1.8 EHP 4個孢壁蛋白基因序列測序及鑒定

將EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)這4個孢壁蛋白氨基酸序列一致性為16.14%（圖2）。在這4個孢壁蛋白中，EhEnP1和EhSWP7的氨基酸序列一致性最高，也僅為13.51%，表明4個孢壁蛋白相互之間的相似性很低，屬于4個不具有序列相似性的蛋白。

取凡納濱對蝦肝胰腺組織進行涂片，鏡檢結(jié)果顯示，肝胰腺組織中存在大量的微孢子蟲孢子樣結(jié)構(gòu)，初步判斷該批對蝦很可能存在EHP感染。為進一步確認鏡檢結(jié)果，作者對該批對蝦開展了EHP的PCR檢測。結(jié)果如圖1所示：檢測的16只對蝦中，有10只蝦檢測到目的條帶，確認EHP感染陽性，陽性率為62.5%，據(jù)此判斷該對蝦養(yǎng)殖場存在嚴(yán)重的EHP感染。

1.9 生物信息學(xué)分析

為分析4個孢壁蛋白基因在EHP感染對蝦不同組織中的表達量，本研究借助熒光定量PCR技術(shù)檢測了孢壁蛋白基因在對蝦肝胰腺、鰓、腸和胃組織中的表達水平。根據(jù)4個孢壁蛋白基因的cDNA序列，設(shè)計的4對特異性引物序列見表2。此外，對蝦延伸因子EF-1α被選為內(nèi)參基因，用于計算4個孢壁蛋白基因的相對表達量。熒光定量檢測使用上述合成的第一鏈cDNA為模板，具體反應(yīng)體系為：2×SYBR premix ExTaqTM10μL，1μmol·mL-1上下游引物（EF和ER）各4 μL，cDNA模板2μL，總體積20μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min；隨后進行40個循環(huán)擴增（95℃變性10 s，60℃退火延伸60 s）；最后將樣品從60℃逐漸升溫至95℃，每升高0.5℃檢測1次熒光值，用于熔解曲線分析。用SPSS 17.0進行t檢驗和差異顯著性分析，當(dāng)P＜0.05時視為差異顯著。

1.3.2 松弛療法 指通過一定的肌肉松弛訓(xùn)練程序，有意識地控制自身的生理心理活動，降低喚醒水平，改善軀體及心理功能紊亂狀態(tài)，達到治療疾病的作用［10］。

筆者作為陜西農(nóng)墾集團朝邑農(nóng)場有限公司外派到蘇墾農(nóng)發(fā)新洋分公司掛職的干部，全程參加了新洋分公司2018年三秋工作。新洋分公司運用現(xiàn)代公司化管理模式，依靠科技創(chuàng)新，落實關(guān)鍵技術(shù)措施，發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)。新洋分公司發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的公司化管理模式，值得陜西農(nóng)墾借鑒學(xué)習(xí)。

2015年北海市通過開展大量的實地調(diào)研考察，對收集到的建筑工程中常見問題，有針對性地給出了解決辦法，匯總編制成《北海市建設(shè)工程質(zhì)量安全管理標(biāo)準(zhǔn)化圖集》，用于指導(dǎo)施工企業(yè)按圖索驥，進行標(biāo)準(zhǔn)化施工，最大限度地降低質(zhì)量通病的發(fā)生，使北海市建筑工程質(zhì)量整體水平得到明顯的提升。特別是住宅工程中滲漏、裂縫、空鼓、空間尺寸偏差等通病得到了有效控制，投訴信訪案件發(fā)生率逐年穩(wěn)步下降，人民群眾對住宅工程的滿意度持續(xù)提高。

1.10 4個孢壁蛋白基因在EHP感染對蝦不同組織的表達分析

用在線翻譯軟件（http：／／web.expasy.org／translate／）將EHP孢壁蛋白基因的cDNA序列翻譯成氨基酸序列。用在線軟件SingalP 5.0預(yù)測孢壁蛋白氨基酸序列的信號肽，并在線計算孢壁蛋白理論分子量和等電點（http：／／web.expasy.org／compute＿pi／）。用在線比對工具BLASTP分析EHP孢壁蛋白與其他微孢子蟲孢壁蛋白的相似性，并用DNAMAN軟件分析孢壁蛋白氨基酸序列間的相似性，以及cDNA序列中ORF區(qū)序列與對應(yīng)DNA序列的一致性。

休閑制約協(xié)商更加強調(diào)人對制約因素的積極能動作用，進一步拓展了休閑制約的研究內(nèi)容。當(dāng)然，如何檢驗和測量休閑制約協(xié)商過程中的各種干預(yù)因素也成為研究難點，同時是推動研究向縱深方向發(fā)展的關(guān)鍵點。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏡檢及PCR檢測結(jié)果

二是要按照生態(tài)文明建設(shè)、保護優(yōu)先和節(jié)約集約的要求來開展改革創(chuàng)新工作。明年工作要把改革擺在重要位置，深度全面地推進各項工作，并在原來基礎(chǔ)上要有所拓展。

2.2 EHP 4個孢壁蛋白基因初步鑒定結(jié)果

通過轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析，從EHP感染陽性對蝦肝胰腺中鑒定到4個孢壁蛋白樣基因，分別 命 名 為EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26。通過BLASTP在線比對發(fā)現(xiàn)，這4個基因編碼的氨基酸序列，分別與泰國研究團隊經(jīng)基因組測序得到的EHP孢壁蛋白EHP00＿1402（蛋白編號：OQS54765.1）、SWP7（OQS55031.1）、SWP12（OQS53422.1）和孢子蛋白（OQS53873.1）的氨基酸序列一致。此外，我們進一步分析了4個孢壁蛋白氨基酸序列與其他孢壁蛋白序列的相似性。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

利用qRT-PCR檢測了EHP 4個孢壁蛋白基因在不同組織的表達水平，實驗結(jié)果將鰓組織中各基因的表達設(shè)為1，肝胰腺中這4個基因（EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26）的表達量分別約為鰓組織表達量的118、358、1843、297倍（圖3-A～D）。結(jié)果表明：這4個基因均在肝胰腺組織中表達量最高，在鰓組織中表達量最低（P＜0.05）；各基因在胃和腸組織中的表達量比較接近。提示EHP侵染的主要組織是肝胰腺。

2.3 EHP 4個孢壁蛋白基因的序列特征

進一步序列分析發(fā)現(xiàn)，EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26的cDNA序列全長分別為1 002、779、756、718 bp，其開放閱讀框（ORF）分別為1 002、753、735、687 bp，分別編碼333、250、244、228個氨基酸，預(yù)測的理論分子量分別為38.3、25.3、28.7、25.7 kDa，計算的理論等電點分別為8.86、5.04、9.05、5.12，提交的基因編號分別 為 MN604019、MN604020、MN604021 和MN604022。用SignalP 5.0在線分析4個孢壁蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)僅EhSWP7蛋白含有信號肽（第1至21位氨基酸）。在線軟件SMART分析結(jié)果顯示，只有EhSWP26 預(yù)測到1個MICSWaP結(jié)構(gòu)域（第28至222位氨基酸）。

2.4 4個孢壁蛋白氨基酸序列的相似性分析

將上述PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，按照核酸回收試劑盒（大連TakaRa）說明對目的片段進行回收。隨后將4個核酸片段分別連接到pMD-19T載體中，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，對藍白斑篩選及PCR篩選均為陽性的菌株進行增殖培養(yǎng)，菌液樣品送至上海瑞迪生物科技公司進行測序。

2.5 4個孢壁蛋白基因的cDNA序列和基因組序列的相似性分析

進一步擴增4個孢壁蛋白基因開放閱讀框?qū)?yīng)的基因組序列，分別進行序列相似性比較，發(fā)現(xiàn)4個孢壁蛋白基因的cDNA序列與對應(yīng)的基因組序列分別一致，結(jié)果表明4個孢壁蛋白基因?qū)?yīng)的DNA序列中沒有內(nèi)含子序列。

2.6 EHP 4個孢壁蛋白基因在不同組織中的表達水平

BLASTP結(jié)果顯示：EhEnP1與柑橘鳳蝶（Papilio xuthus）微孢子蟲EnP1樣孢壁蛋白（XP＿013175528.1）的一致性為40.79%，表明兩者屬于同源分子，因此將該孢壁蛋白命名為EhEnP1。與此類似，EhSWP7 與中華絨螯蟹肝胞蟲（Hepatospora eriocheir）的孢壁蛋白 SWP7（ORD97919.1）的一致性高達40.57%，EhSWP12與黃道蟹腸孢蟲（Enterospora canceri）的孢壁蛋白SWP12（ORD93985.1）的一致性高達50.63%，故將EHP這兩個孢壁蛋白分別命名為EhSWP7和EhSWP12。此外，EhSWP26與果蠅微孢子蟲假定孢壁蛋白（RVD91259.1）的一致性是24.59%，與水蚤微孢子蟲（Hamiltosporidium magnivorad）假定孢壁蛋白 （TBU08151.1）和 微孢子蟲（Hamiltosporidium tvaerminnensis）假定孢壁蛋白（TBU01699.1）的一致性均是20.61%。從上述比對結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該類孢壁蛋白在其他物種中也沒有確切的命名，由于該孢壁蛋白理論分子量為25.7 kDa，大 小 接 近26 kDa，故 暫 命 名 為EhSWP26。

2.7 EHP 4個孢壁蛋白基因在肝胰腺和胃兩個組織中的表達分析

為確保實驗結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性和準(zhǔn)確性，將4個孢壁基因在2個高表達組織中（肝胰腺和胃）的相對表達量分別進行計算和比較。結(jié)果顯示，在肝胰腺組織中4個基因（依次為EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26，下同）相對同一個內(nèi)參基因的表達量分別為0.041、0.050、0.232和0.054，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，表達量如圖4-A所示，它們之間的比例關(guān)系約為1∶1∶4∶1。在胃組織中，這4個基因表達量分別為0.006 4、0.01、0.016 6和0.006 2，將計算結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化后，表達量如圖4-B所示，它們之間的比例關(guān)系約為1∶1.5∶3∶1。上述結(jié)果表明，4個孢壁蛋白基因在2種不同組織中的表達模式有一定的相似性。其中，EhEnP1和EhSWP26的表達量較為一致，表明它們在EHP的蛋白構(gòu)成比例可能也相似；EhSWP7含量約為EhEnP1的1～1.5倍，表明在EHP的蛋白構(gòu)成中可能前者稍高于后者或兩者相似；EhSWP12的表達量約為EhEnP1的3～4倍，在這4個基因中表達量最高，由此推測EhSWP12在EHP蛋白組成中含量也高于其他3種蛋白。

圖2 蝦肝腸孢蟲Eh EnP1、Eh SWP7、Eh SWP12和Eh SWP26的氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of four SWP am ino acids of EHP

圖3 4個孢壁蛋白基因在不同組織中的表達水平Fig.3 Expression levels of four spore wall protein genes in different tissues

圖4 4個孢壁蛋白基因在肝胰腺和胃組織中的相對表達量Fig.4 Relative expression levels of four spore wall proteins genes in hepatopancreas and stomach

3 討論

近年來，在浙江、粵西、遼寧、天津等多個對蝦養(yǎng)殖區(qū)域均檢出了EHP感染［19-23］。本研究發(fā)現(xiàn)，來自上海郊區(qū)的這批凡納濱對蝦EHP感染率高達62.5%，進一步表明EHP感染在我國對蝦養(yǎng)殖區(qū)域較為普遍。由于EHP最早在泰國斑節(jié)對蝦中被檢測到［1］，并將其認定為微孢子蟲屬的一個新種［2］，這給我國研究人員提出了一個重要科學(xué)問題：在我國暴發(fā)流行的EHP與泰國流行株是否屬于同一個種；此外，EHP作為一種簡單真核生物，是否會像病毒、細菌等原核生物一樣常因環(huán)境選擇壓力導(dǎo)致部分基因發(fā)生變異，這些問題目前還不清楚。為此，本研究通過基因克隆獲取了EHP的4個孢壁蛋白基因的DNA序列，序列比較發(fā)現(xiàn)，它們分別與泰國當(dāng)?shù)谽HP孢壁蛋白基因的DNA序列一致，這表明上海養(yǎng)殖場的該對蝦微孢子蟲和泰國當(dāng)?shù)谽HP極有可能屬于同一個種。考慮到4個孢壁蛋白基因的序列均沒有出現(xiàn)變異現(xiàn)象，提示該真核生物具有不易受環(huán)境改變而產(chǎn)生基因變異的特點。此外，研究還發(fā)現(xiàn)這4個孢壁蛋白基因?qū)?yīng)的DNA序列中均不含內(nèi)含子，與原核生物基因組結(jié)構(gòu)中不含內(nèi)含子的特征非常相似，這也是早期研究將微孢子蟲歸為原核生物的重要原因之一，研究結(jié)果也從另一角度揭示微孢子蟲屬于低等真核生物。

微孢子蟲的孢壁主要由孢壁蛋白和纖維狀幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。孢壁蛋白位于微孢子蟲孢子最外層，研究表明某些孢壁蛋白能與宿主細胞表面組分直接接觸，參與侵染過程［14-15］。對孢壁蛋白進行鑒定并研究其生物學(xué)功能，對于闡明微孢子蟲侵染機制以及其與宿主之間的關(guān)系非常重要。雖然目前EHP孢壁蛋白的研究報道較少見，但來源于家蠶、蜜蜂、蝗蟲等微孢子蟲的孢壁蛋白報道較多，其中家蠶微孢子蟲孢壁蛋白的研究最多，有深入研究的已達10種［15，24-35］。據(jù)此推測，對蝦EHP孢壁蛋白也應(yīng)該有多種類別。因此對多種不同類別孢壁蛋白采取一定方式合理命名，對后續(xù)功能研究具有重要意義。在本研究之前，JAROENLAK等［16］于2018年報道了EHP的第一個孢壁蛋白EhSWP1，它有含肝素結(jié)合基序和BAR結(jié)構(gòu)域，推測其可能參與EHP感染。通過序列分析，筆者發(fā)現(xiàn)EhSWP1與兔腦炎微孢子蟲孢壁蛋白EnP1屬于同類蛋白，兩者相似性較高且都具有肝素結(jié)合基序和BAR結(jié)構(gòu)域［36］。此外，本研究也鑒定了一個EnP1樣孢壁蛋白基因EhEnP1，但EhEnP1蛋白不含肝素結(jié)合基序和BAR結(jié)構(gòu)域，其命名主要是基于EhEnP1與柑橘鳳蝶EnP1樣蛋白具有較高相似度。由此筆者認為EnP1樣蛋白之間的生物學(xué)功能應(yīng)該存在明顯差異。鑒于目前對該類蛋白生物學(xué)功能了解有限，還需隨著功能研究的深入，對該類蛋白進一步命名，避免因蛋白名稱類似而混淆不同種類蛋白。由于EhSWP7和EhSWP12均能在各自BLASTP結(jié)果中找到高相似性的同源蛋白基因，因此這兩個孢壁蛋白命名較為合理。至于EhSWP26，其BLASTP結(jié)果中并沒有發(fā)現(xiàn)高相似性的已命名孢壁蛋白基因，根據(jù)未知蛋白常見命名方法，筆者依據(jù)其分子量大?。?6 kDa），暫命名為EhSWP26。目前EHP孢壁蛋白功能研究報道很少，筆者通過生物信息學(xué)分析，僅發(fā)現(xiàn)EhSWP26包含功能域，多數(shù)孢壁蛋白功能無法預(yù)測。因此，確切命名上述孢壁蛋白還需要更深入的功能研究。

本研究通過qRT-PCR方法，分析了在EHP感染對蝦中孢壁蛋白基因的表達特點，4個孢壁蛋白基因均在肝胰腺中表達量最高，表明EHP主要侵染肝胰腺組織。此外，研究還發(fā)現(xiàn)4個孢壁蛋白基因在胃和腸中也存在較低水平的表達，這與之前報道這2個組織也存在EHP感染的描述類似［37-41］。雖然在鰓中也檢測到孢壁蛋白基因的表達，但與肝胰腺中相比，其表達量非常低，一般不認為是EHP侵染的組織。在鰓中檢測到的原因可能是對蝦本身開放的血淋巴循環(huán)系統(tǒng)攜帶一定量EHP或病原核酸所致。

其中i表示研究個體即西部12個省(區(qū)市)，t表示時間即從2003年到2016年，xit表示除了金融發(fā)展因素外對地區(qū)經(jīng)濟增長有較大影響的控制變量,包括消費、投資、政府支出、對外依存度和社會勞動力。FDit是與區(qū)間相關(guān)的依賴變量即金融發(fā)展水平。HCit是門檻變量即人力資本存量，因為人力資本水平對地區(qū)經(jīng)濟增長也有重要影響，在這里也把它加入控制變量之中。γ是研究中待估計的門檻值。I(°)為指標(biāo)函數(shù)，其相應(yīng)的括號內(nèi)條件成立時取值為1，否則取值為0。μi為不隨時間變化的個體效應(yīng)，eit為隨機干擾項。進一步地，(1)式可以轉(zhuǎn)化為：

除探明了EHP侵染各組織的情況，本研究還通過比較4個孢壁蛋白基因在感染組織中表達水平，明確了EhSWP12是EHP孢壁蛋白主要組分，推測其可能在EHP侵染過程中發(fā)揮重要作用，這為EHP侵染機制等功能研究奠定了基礎(chǔ)。雖然利用傳統(tǒng)的蛋白鑒定方法（如雙向電泳和質(zhì)譜鑒定）研究結(jié)果更為直接、可靠，但在不易獲取高純度孢子的條件下，利用孢壁蛋白基因表達水平間接預(yù)測EHP蛋白構(gòu)成情況，可能是探索EHP孢壁蛋白含量和組成的一種更為有效的手段。盡管存在轉(zhuǎn)錄后修飾等過程，對得到孢壁蛋白的真實組成情況還存在不確定性，但本研究至少提供了一些有價值的信息，如EhSWP12為EHP高含量孢壁蛋白。此外，EHP感染周期很長且感染對蝦死亡率不高，暗示在EHP感染中后期，對蝦體內(nèi)EHP基因的表達水平相對穩(wěn)定，也意味著EHP蛋白表達和組成相對平衡，這表明利用EHP感染中后期孢壁蛋白基因的表達水平推測其蛋白組成情況具有可行性。

4 小結(jié)

本研究對EHP的4個假定孢壁蛋白基因進行了序列分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)其表達的4個孢壁蛋白彼此相似性很低，應(yīng)屬于4個不同的孢壁蛋白基因；它們與泰國當(dāng)?shù)谽HP相應(yīng)孢壁蛋白基因的序列一致且不易受環(huán)境影響發(fā)生突變，表明上海本地和泰國當(dāng)?shù)貙ξrEHP很可能屬于同一個種。表達研究發(fā)現(xiàn)，4個孢壁蛋白基因均在肝胰腺中表達水平最高，且EhSWP12表達水平明顯高于其他3個基因，表明EHP主要侵染肝胰腺組織，EhSWP12是EHP孢壁蛋白主要組分，很可能在EHP侵染過程中發(fā)揮重要作用。本研究為后期開展EHP病原生物學(xué)及感染機制研究提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)。