徐文剛，劉立明，唐永政，王九龍，于文松，征矢野清，鄒華鋒

（1.煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005；2.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東煙臺(tái) 264003；3.長(zhǎng)崎大學(xué)環(huán)東シナ海環(huán)境資源研究センター，日本長(zhǎng)崎 851-2213；4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

石斑魚(yú)（Epinephelus）隸屬于鱸形目（Perciformes），鮨科（Serranidae），石斑魚(yú)亞科（Epinephelinae），廣泛分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)以及其他亞洲國(guó)家的溫帶和熱帶海域，因其高品質(zhì)的魚(yú)肉和較高的商業(yè)價(jià)值而被認(rèn)為是重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一［1-2］。石斑魚(yú)的人工養(yǎng)殖主要集中在我國(guó)廣東、海南和福建，其產(chǎn)量逐年增加并在2018年達(dá)到13.15萬(wàn)t［3］。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)石斑魚(yú)養(yǎng)殖生物學(xué)的研究報(bào)道主要集中在雜交試驗(yàn)［4-6］、環(huán)境脅迫［7］、營(yíng)養(yǎng)成分分析［8］以及形態(tài)發(fā)育［9］等方面，有關(guān)其體長(zhǎng)、年齡與性成熟、性逆轉(zhuǎn)以及內(nèi)分泌激素之間聯(lián)系的研究較少報(bào)道。

硬骨魚(yú)類的生活史包含生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟和繁殖階段，其中性成熟受到內(nèi)分泌激素的調(diào)節(jié)和體長(zhǎng)、年齡以及與繁殖相關(guān)環(huán)境因子的綜合影響。大量研究表明，魚(yú)類性成熟的開(kāi)始與體長(zhǎng)和年齡因素相關(guān)。日本學(xué)者OKUZAWA［10］認(rèn)為，魚(yú)類初次性成熟與體長(zhǎng)密切相關(guān)，當(dāng)魚(yú)類生長(zhǎng)規(guī)格達(dá)到或超過(guò)性成熟所需要的最小體長(zhǎng)時(shí)，即可視為初次成熟的開(kāi)始，之后個(gè)體中成熟比例隨著體長(zhǎng)的增加而增加。對(duì)竹?魚(yú)（Trachurus japonicus）的研究［11］表明，當(dāng)其叉長(zhǎng)超過(guò)19～23 cm的生物學(xué)最小形時(shí)即達(dá)到成熟。也有研究表明，魚(yú)類初次性成熟與年齡密切相關(guān)，澳大利亞的墨瑞鱈（Maccullochella peelii peelii）在4齡后才達(dá)到性成熟［12-13］；而牙鲆（Paralichthys olivaceus）雌魚(yú)隨著體長(zhǎng)和年齡的增加其成熟率也逐漸提高［14］。然而有關(guān)石斑魚(yú)初次性成熟與體長(zhǎng)和年齡關(guān)系的研究?jī)H在赤點(diǎn)石斑魚(yú)（Epinephelus akaara）［15］和黑邊石斑魚(yú)（E.fasciatus）［16］中有少量報(bào)道。

黑邊石斑魚(yú)廣泛分布于我國(guó)南海［2］以及印度洋和太平洋［16-17］，是一種棲息于熱帶和亞熱帶地區(qū)的中小型石斑魚(yú)類，其味道鮮美，具有很高的商業(yè)價(jià)值，是東亞地區(qū)重要的水產(chǎn)資源。黑邊石斑魚(yú)屬于雌雄同體、先雌后雄的海水魚(yú)類。目前日本東京都小笠原群島每年進(jìn)行黑邊石斑魚(yú)苗種的生產(chǎn)和放流［18］，以增加其漁獲產(chǎn)量。對(duì)日本長(zhǎng)崎市沿岸海域市場(chǎng)的調(diào)查表明，通過(guò)垂釣或網(wǎng)捕所得漁獲物中黑邊石斑魚(yú)的數(shù)量大幅增加，但捕獲個(gè)體的規(guī)格卻逐年減小。黑邊石斑魚(yú)原屬南海主要珊瑚礁魚(yú)類［2］，近年隨著日本近海水溫的上升，其棲息地北遷至長(zhǎng)崎沿岸海域。研究表明，在人工養(yǎng)殖環(huán)境下，其滿1齡時(shí)體長(zhǎng)為16.6 cm，滿2齡時(shí)為23.5 cm［16］，2～3齡時(shí)性腺發(fā)育成熟［18］，此前均為雌性，之后經(jīng)過(guò)短暫的間性過(guò)渡后性逆轉(zhuǎn)為雄性。由于地域和環(huán)境的不同，其產(chǎn)卵期和性成熟規(guī)格也有差異。如在菲律賓熱帶海域，黑邊石斑魚(yú)雌性成熟個(gè)體體長(zhǎng)為14～28 cm，成熟且完成卵黃蓄積后能夠全年進(jìn)行產(chǎn)卵［19］，而在小笠原群島其產(chǎn)卵期在4—6月，性成熟體長(zhǎng)24 cm［20］。此外養(yǎng)殖條件的差異也會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)卵期的不同，如自然條件下小笠原群島在4—6月，人工養(yǎng)殖條件下在4—11月［20］。但至今未見(jiàn)長(zhǎng)崎沿岸海域有關(guān)黑邊石斑魚(yú)的生長(zhǎng)和成熟之間關(guān)系的研究報(bào)道。本研究為探明日本長(zhǎng)崎市沿岸海域黑邊石斑魚(yú)性成熟、性逆轉(zhuǎn)期與體長(zhǎng)、年齡之間的關(guān)系，于2015年7月至2018年6月逐月連續(xù)采樣，并對(duì)其體長(zhǎng)、體質(zhì)量、年齡、性別、性腺發(fā)育成熟度和性腺指數(shù)以及血清中雌二醇（17β-Estradiol，E2）含量展開(kāi)了調(diào)查研究，以為今后黑邊石斑魚(yú)的資源調(diào)查和人工繁殖提供更多信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2015年7月至2018年6月，采用漁船捕撈作業(yè)和垂釣法相結(jié)合的方式，在日本長(zhǎng)崎市沿岸海域隨機(jī)捕獲黑邊石斑魚(yú)，分別記錄每月累計(jì)采樣的數(shù)量，樣本數(shù)量總計(jì)297尾。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

所捕獲黑邊石斑魚(yú)用2-苯氧乙醇麻醉后，測(cè)定全長(zhǎng)（total length，TL）和體質(zhì)量（body weight，BW）。從尾柄部采血，血液在1 500 r·min-1、4℃離心機(jī)中離心20 min后取上層血清保存于-80℃冰箱。之后取出性腺，測(cè)定質(zhì)量（gonadal weight，GW），計(jì)算性腺指數(shù)（gonadosomatic index，GSI），公式為：

將性腺固定在波恩試劑中，24～48 h后轉(zhuǎn)移至70%的酒精中保存用于組織學(xué)分析。之后取出位于腦下部的耳石，左右各一個(gè)，將其保存在70%的乙醇或蒸餾水中，用于年齡的測(cè)定。

1.2.1 性腺組織學(xué)觀察

對(duì)黑邊石斑魚(yú)性腺進(jìn)行常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5μm。采用蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹(shù)膠封片，Olympus FX380型光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，以切片圖中性細(xì)胞最發(fā)達(dá)階段作為性腺的發(fā)育階段。性腺中若觀察到卵母細(xì)胞的個(gè)體為雌性；同時(shí)觀察到卵細(xì)胞和精細(xì)胞的個(gè)體為間性；觀察到精原細(xì)胞、精母細(xì)胞或精子的個(gè)體為雄性。此外，雌性參考國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究［21-23］對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育情況作A～G分期。

1.2.2 耳石加工和年齡的鑒定

耳石加工和年齡的鑒定參照文獻(xiàn)［24-25］中的方法加以改進(jìn)，具體過(guò)程如下，將半片膠囊（Kobayashi Capsulae Co.，Ltd.，Japan）投入到牙科用樹(shù)脂（Shofu Inc.，Japan）中后迅速將耳石垂直包埋其中，包埋后的耳石放置在低速精密切斷機(jī)（MetaServTM250-Single，Switzerland）上于中心部位沿短軸方向切開(kāi)，厚度約1.5 mm左右。之后置于研磨機(jī)（MetaServTM 250-Single，Switzerland）上研磨至厚度約0.5 mm。在1%鹽酸溶液中浸泡20 s后于1%甲苯胺藍(lán)溶液中染色60 s，最后用透明指甲油固定在載玻片上，在顯微鏡下根據(jù)所觀察到的輪紋數(shù)鑒定黑邊石斑魚(yú)的年齡。

1.2.3 血清中雌二醇含量的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)中雌二醇（17β-Estradiol，E2）的檢測(cè)參照左永松等［26］的方法進(jìn)行測(cè)定，具體過(guò)程如下，-80℃冷凍的血清樣品經(jīng)過(guò)4℃解凍離心后取得上層血清，血清經(jīng)過(guò)甲醇-乙醚低溫冷凍蒸發(fā)系統(tǒng)進(jìn)行類固醇的提純，經(jīng)3次冷凍蒸發(fā)后的血清樣品可用于檢測(cè)。E2的測(cè)定采用Cayman Chemical公司購(gòu)置的EIA（enzyme immunoassy）酶聯(lián)免疫試劑盒。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（means±SEM）。采用Kolmogorov-Smirnov法進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)，利用ANOVA檢驗(yàn)以及Tukey’s HSD法進(jìn)行差異性比較分析，取P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑邊石斑魚(yú)的累計(jì)數(shù)量及其生長(zhǎng)指數(shù)的變化

2015年7月至2018年6月，每月捕獲黑邊石斑魚(yú)的累計(jì)數(shù)量及其生長(zhǎng)指數(shù)的變化如表1所示。黑邊石斑魚(yú)體長(zhǎng)在9月顯著高于5、6、8、10、12月（P＜0.05），體質(zhì)量在9月顯著高于1、2、5、6、8、10、11、12月（P＜0.05）；其性腺質(zhì)量和GSI的變化一致，兩者均在7月顯著高于1—5月和8—12月（P＜0.05）。

2.2 未成熟與成熟雌性、間性和雄性個(gè)體累計(jì)數(shù)量及其比例的變化

調(diào)查期黑邊石斑魚(yú)性腺發(fā)育各階段切片如圖1所示，其中未成熟雌性性腺發(fā)育見(jiàn)圖1-A～B，成熟雌性見(jiàn)圖1-C～G，間性圖1-H，雄性圖1-I。調(diào)查期每月未成熟與成熟雌性、間性和雄性個(gè)體累計(jì)數(shù)量及其比例的變化如表2所示。每月均觀察到未成熟雌性個(gè)體，其比例在1—5月較高，在3月和5月均達(dá)到100%；在6—12月較低，其中7月最低，僅為20.7%。在1、2、4及6—11月觀察到成熟雌性個(gè)體，在6—8月比例較高，6月為45.5%，7月升至最高為64.6%，8月為43.8%；之后逐漸降低，在11月僅為7.1%。此外，在7、8、11、12月觀察到間性個(gè)體；在1、7、8、10、11、12月觀察到雄性個(gè)體。每月間性和雄性個(gè)體比例為0～30%，均較雌性個(gè)體比例低。

2.3 7月未成熟與成熟雌性、間性和雄性個(gè)體累計(jì)數(shù)量、生長(zhǎng)指數(shù)、GSI和年齡的差異

根據(jù)表2的結(jié)果，取成熟雌性比例最高的調(diào)查期7月累計(jì)捕獲的82尾黑邊石斑魚(yú)統(tǒng)計(jì)未成熟與成熟雌性、間性和雄性個(gè)體累計(jì)數(shù)量、生長(zhǎng)指數(shù)、GSI及年齡如表3所示。間性和雄性個(gè)體體長(zhǎng)和體質(zhì)量均顯著高于未成熟和成熟雌性個(gè)體（P＜0.05）。成熟雌性的性腺質(zhì)量和GSI顯著高于未成熟雌性、間性以及雄性（P＜0.05）。未成熟和成熟雌性的年齡在2～4齡，間性在9齡，雄性在7～12齡。

表1 調(diào)查期月捕獲黑邊石斑魚(yú)累計(jì)數(shù)量及其生長(zhǎng)指數(shù)的變化Tab.1 Changes of cumulative number and grow th index of Epinephelus fasciatus in each month from July 2015 to June 2018

2.4 7月雌性黑邊石斑魚(yú)年齡、性腺發(fā)育階段、累計(jì)數(shù)量、生長(zhǎng)指數(shù)、GSI和雌二醇含量的變化

根據(jù)表3的結(jié)果，取成熟雌性比例最高的調(diào)查年7月累計(jì)捕獲的70尾雌性黑邊石斑魚(yú)統(tǒng)計(jì)其年齡、性腺發(fā)育階段、累計(jì)數(shù)量、生長(zhǎng)指數(shù)、GSI和雌二醇（E2）含量的變化如表4所示。在2齡魚(yú)中未檢測(cè)到成熟個(gè)體，其性腺發(fā)育檢測(cè)為核仁外周期（Pn）和卵黃囊泡期（Yv）階段，各指標(biāo)均無(wú)顯著性差異，其Yv階段體長(zhǎng)為（21.92±0.83）cm，GSI為（0.35±0.04）%，E2含量為（73.38±12.94）pg·mL-1。3齡魚(yú)中開(kāi)始檢測(cè)到三級(jí)卵黃球期（Ty）階段成熟個(gè)體，其體長(zhǎng)為（24.52±1.55）cm，GSI為（4.05±1.24）%，E2含量為（247.28±45.34）pg·mL-1。4齡魚(yú)中大部分個(gè)體檢測(cè)為Ty階段成熟個(gè)體，其體長(zhǎng)為（28.96±0.51）cm，GSI為（3.89±0.63）%，E2含量為（253.88±45.47）pg·mL-1。5齡魚(yú)的性腺發(fā)育檢測(cè)均為完熟期（R）階段。

3齡魚(yú)的性腺發(fā)育檢測(cè)為Pn、Yv、Ty和核移動(dòng)期（Mn）階段，其中Ty和Mn階段的性腺質(zhì)量、GSI和E2含量顯著高于Pn階段（P＜0.05），Ty和Mn階段的E2含量顯著高于Pn和Yv階段（P＜0.05）。4齡魚(yú)的性腺發(fā)育檢測(cè)為Yv、Ty和R階段，其中Ty和R階段的性腺質(zhì)量、GSI和E2含量顯著高于Yv階段（P＜0.05）。

圖1 不同發(fā)育階段黑邊石斑魚(yú)性腺切片圖Fig.1 Histological sections of different gonadal developmental stages of Epinephelus fasciatus

3 討論

3.1 黑邊石斑魚(yú)卵巢發(fā)育成熟期的推測(cè)及其與E2之間的聯(lián)系

本研究中，在長(zhǎng)崎市沿岸海域捕獲的黑邊石斑魚(yú)在6—8月觀察到較高比例的成熟雌性個(gè)體，且其GSI和成熟比例均在7月達(dá)到峰值。已有研究表明，褐石斑魚(yú)（E.bruneus）卵黃球形成期出現(xiàn)在4月且在5—6月確認(rèn)產(chǎn)卵［27］。七帶石斑魚(yú)（E.septemfasciatus）卵黃囊泡以及卵黃球形成期在3月，5月迎來(lái)產(chǎn)卵期［28］。蜂巢石斑魚(yú)（E.merra）產(chǎn)卵期在5—7月［26，29］。赤點(diǎn)石斑魚(yú)［30］和鞍帶石斑魚(yú)（E.lanceolatus）［31］的人工繁殖期分別在6—9月和7—9月。已有研究表明，長(zhǎng)崎地區(qū)黑邊石斑魚(yú)性腺在2017年7月和8月能發(fā)育成熟并產(chǎn)卵，是水溫、性激素E2和性成熟激素DHP共同調(diào)節(jié)所致［32］。以上結(jié)果表明，由于石斑魚(yú)種類的不同，其性腺發(fā)育成熟和產(chǎn)卵期也會(huì)有所差異，在長(zhǎng)崎市沿岸海域海水水溫每年變化不大的情況下，黑邊石斑魚(yú)性成熟期大致在7月。

表2 調(diào)查期各月未成熟與成熟雌性、間性和雄性個(gè)體累計(jì)數(shù)量及其比例Tab.2 Changes of cumulative number and proportion between the immature and mature female，intersex，and male Epinephelus fasciatus in each month from July 2015 to June 2018

表3 調(diào)查期7月未成熟與成熟雌性、間性和雄性個(gè)體累計(jì)數(shù)量、生長(zhǎng)指數(shù)、GSI和年齡的差異Tab.3 Differences of cumulative number，grow th index，GSI，and age between the immature and mature female，intersex，and male Epinephelus fasciatus in July from July 2015 to June 2018

表4 調(diào)查期7月雌性黑邊石斑魚(yú)年齡、性腺發(fā)育階段、累計(jì)數(shù)量、生長(zhǎng)指數(shù)、GSI和雌二醇（E2）含量的變化Tab.4 Changes of age，gonadal developmental stage，cumulative number，grow th index，GSI，and 17β-Estradiol（E2）content of Epinephelus fasciatus in July from July 2015 to June 2018

大量研究［33］表明，魚(yú)類腦垂體分泌的促性腺激素（gonadotropins，GtHs）能夠誘導(dǎo)性腺合成性激素E2，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。本研究3齡和4齡成熟雌性個(gè)體中E2含量和GSI顯著高于未成熟雌性個(gè)體，表明E2在誘導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中起重要作用。以往的研究表明［32］，黑邊石斑魚(yú)E2含量在成熟季節(jié)顯著高于非成熟季節(jié)。斜帶石斑魚(yú)（E.coioides）成熟雌魚(yú)血清中E2含量在生殖季節(jié)最高，且其平均性腺成熟系數(shù)GSI也顯著高于其他月份，表明其血清E2水平的季節(jié)變化與性腺成熟系數(shù)的變化基本一致，都是在生殖季節(jié)達(dá)到最高峰［34］。此外，給鯔（Mugil dussumieri）注射外源激素E2能夠誘導(dǎo)其性腺發(fā)育成熟［35］。斜帶髭鯛（Hapalogenys nitens）血清中E2含量在產(chǎn)卵期之前達(dá)到最高值，且其變化趨勢(shì)與卵母細(xì)胞發(fā)育和GSI的變化一致［36］。本研究中黑邊石斑魚(yú)成熟階段性激素和GSI的變化趨勢(shì)與上述結(jié)果一致，表明E2含量的增加與卵巢發(fā)育成熟密切相關(guān)。

3.2 黑邊石斑魚(yú)體長(zhǎng)、年齡與性成熟、性逆轉(zhuǎn)之間的聯(lián)系

本研究中2齡黑邊石斑魚(yú)最小體長(zhǎng)為21.4 cm，3齡為24.5 cm，4齡為27.8 cm。已有研究表明［17］，在日本小笠原人工養(yǎng)殖的黑邊石斑魚(yú)最小體長(zhǎng)2齡為23.5 cm，3齡為27.6 cm。本研究中的黑邊石斑魚(yú)均為長(zhǎng)崎市沿岸海域捕獲，因此其體長(zhǎng)與小笠原人工養(yǎng)殖的有所差異。本研究中黑邊石斑魚(yú)在3齡時(shí)檢測(cè)到成熟個(gè)體，而小笠原養(yǎng)殖群體的成熟期在2～3齡［17］。褐石斑魚(yú)在3齡時(shí)出現(xiàn)成熟個(gè)體，但比例較低，僅為4%；4～6齡時(shí)成熟率分別為45%、63%和63%，隨著年齡的增長(zhǎng)成熟率逐漸增加［37］。赤點(diǎn)石斑魚(yú)在2～3齡時(shí)出現(xiàn)成熟個(gè)體［38］，表明不同種類石斑魚(yú)成熟的年齡也不相同。本研究中3齡成熟個(gè)體的體長(zhǎng)在24.5 cm左右，隨著體長(zhǎng)的增加，成熟個(gè)體的數(shù)量也逐漸增加，表明長(zhǎng)崎市沿岸海域黑邊石斑魚(yú)初次性成熟年齡在3齡、體長(zhǎng)在24.5 cm左右。

魚(yú)類性逆轉(zhuǎn)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，雌性先熟的雌雄同體魚(yú)類（如石斑魚(yú)）在自然條件下激素的平衡首先趨向于雌性發(fā)育成熟，直到產(chǎn)卵后的一定發(fā)育階段才開(kāi)始產(chǎn)生卵巢退化、精巢發(fā)育的性逆轉(zhuǎn)過(guò)程［39］。本研究中黑邊石斑魚(yú)在體長(zhǎng)35.7 cm左右、9齡時(shí)檢測(cè)到間性個(gè)體；體長(zhǎng)36.7 cm左右、7～12齡時(shí)檢測(cè)到雄性個(gè)體，表明其性逆轉(zhuǎn)期大致在7～12齡。已有研究表明，自然海區(qū)的石斑魚(yú)性逆轉(zhuǎn)一般發(fā)生在體長(zhǎng)和年齡足夠大的個(gè)體，如赤點(diǎn)石斑魚(yú)發(fā)生在6齡［15，40］，鮭點(diǎn)石斑魚(yú)（E.tauvina）在7齡以上［41-42］，褐石斑魚(yú)在11齡左右［27］。此外，在人工養(yǎng)殖條件下赤點(diǎn)石斑魚(yú)體長(zhǎng)17～24 cm時(shí)性逆轉(zhuǎn)出現(xiàn)雄魚(yú)，但自然環(huán)境下體長(zhǎng)27 cm時(shí)仍未見(jiàn)雄魚(yú)［38］，表明除年齡和體長(zhǎng)外，生活環(huán)境也會(huì)影響石斑魚(yú)性逆轉(zhuǎn)時(shí)期。因此，本實(shí)驗(yàn)中黑邊石斑魚(yú)性逆轉(zhuǎn)期可能受到體長(zhǎng)、年齡和生活環(huán)境的影響。

綜上所述，2015年7月至2018年6月通過(guò)連續(xù)調(diào)查取樣，長(zhǎng)崎市沿岸海域黑邊石斑魚(yú)性成熟期在7月且與E2含量的增加密切相關(guān)，其初次性成熟年齡在3齡，性逆轉(zhuǎn)在7～12齡。本研究結(jié)果為黑邊石斑魚(yú)的資源保護(hù)及人工繁殖方面提供了基礎(chǔ)生物學(xué)資料和理論依據(jù)。