張雪冰，王曉聞，盧亞?wèn)|，張志衡，陳振家

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801）

蕎麥屬禾谷類(lèi)作物，在世界各地廣泛種植，耐寒，在土地貧瘠的地方依然可以良好的生長(zhǎng)，其主要有甜蕎和苦蕎2 種栽培品種[1-3]。蕎麥營(yíng)養(yǎng)成分豐富，蕎麥蛋白含量為15%～17%。蕎麥蛋白是一種天然活性成分，其賴氨酸含量較高，在降血糖、降血脂、提高人體免疫力方面發(fā)揮著重要作用[4-6]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥的蛋白質(zhì)含量豐富，比禾谷類(lèi)含量高[7]。蕎麥蛋白和大豆蛋白相似，具有良好的起泡性、乳化性、持水性等特性。蕎麥蛋白的人體必需氨基酸配比合理，種類(lèi)齊全，是一種全價(jià)蛋白，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[8]，具有生物保健功能[9]。蕎麥蛋白有降低血液中膽固醇、抑制脂肪積蓄、改善便秘、抗衰老以及抑制有害物質(zhì)的吸收等生理作用[10]。目前，蕎麥加工制品主要是利用傳統(tǒng)加工方式制成的產(chǎn)品，如蕎麥面、蕎麥粥等，且對(duì)蕎麥的利用研究較少[11]。由傳統(tǒng)加工方式制成的蕎麥產(chǎn)品并不能完全發(fā)揮蕎麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

本試驗(yàn)對(duì)蕎麥蛋白功能特性及亞基組分進(jìn)行研究，充分了解其加工功能特性，為更好地利用蕎麥中的蛋白質(zhì)提供一定的理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步明確蛋白在食品加工中的適宜性，為開(kāi)發(fā)滿足消費(fèi)者需要的新產(chǎn)品提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蕎麥品種為晉蕎2 號(hào)，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、濃硫酸、石油醚、無(wú)水乙醇、甲醇均為分析純，購(gòu)買(mǎi)于天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；考馬斯亮藍(lán)G250、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、四甲基乙二胺、過(guò)硫酸銨、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、氫氧化鉀、甘油、低分子量蛋白質(zhì)Marker，購(gòu)買(mǎi)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 試驗(yàn)儀器 DYY-7C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；UV-1200 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；HSJ 系列恒溫水浴攪拌器（江蘇科析儀器有限公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-III 循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；TS-2000 多用脫色搖床（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；HC-2064高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；高剪切分散乳化機(jī)（德國(guó)IKA 公司）；JJ-1 大功率電動(dòng)攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蕎麥蛋白的提取 蕎麥粉碎后與石油醚按1∶5（m/V）混合，攪拌8 h 后抽濾，靜置沉淀，待石油醚揮發(fā)完全后即為蕎麥脫脂粉。采用堿提酸沉法將脫脂蕎麥粉與蒸餾水按1∶10（m/V）混合，pH 值8.5、50 ℃恒溫?cái)嚢? h，離心除去不溶物，上清液調(diào)pH 值至4.0，離心取沉淀，水洗沉淀3 次，回調(diào)pH至中性，冷凍干燥備用[12]。

1.3.2 不同pH 和離子強(qiáng)度蛋白溶液的制備 配制1%的蛋白溶液攪拌均勻后，調(diào)節(jié)溶液pH 值（2、3、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12）和稱取氯化鈉以配備不同濃度（0.01、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mol/L）的鹽離子溶液，室溫?cái)嚢? h 后，10 000×g 離心10 min 后取上清液。

1.3.3 蕎麥蛋白溶解度的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定不同pH 和離子強(qiáng)度的蛋白溶液濃度[13]。

1.3.4 蕎麥蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 將不同pH 和離子強(qiáng)度蛋白溶液轉(zhuǎn)至離心管與5 mL的大豆油混合，再用勻漿機(jī)以4 檔位轉(zhuǎn)速將制得溶液均質(zhì)2 min，靜置，分別與0、30 min 時(shí)在離心管底部取20 μL 乳化液與5 mL 0.1%的SDS 溶液均勻混合，在500 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值[14]。根據(jù)公式（1）、（2）計(jì)算燕麥蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性。

式中，A0為0 min 時(shí)的吸光度；N 為稀釋倍數(shù)；c 為樣品濃度（g/mL）；Φ 為乳化液中油相的比例（0.25）；L 為比色杯光徑（1 cm）；A1為30 min 時(shí)的吸光度；t 為30 min（時(shí)間間隔）。

1.3.5 SDS-PAGE 電泳 依照LAEMMLI[15]的方法。濃縮膠濃度和分離膠濃度分別為5%和12%，樣品上樣量為5 μL。恒壓電泳，電流為16 mA，濃縮膠電壓和分離膠電壓分別為100、150 V。電泳結(jié)束后，電泳膠片先固定3 h，再染色，脫色結(jié)束后成像儀成像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用Excel 2010 和Origin 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 對(duì)蕎麥蛋白溶解度的影響

惠麗娟[16]的研究表明，蕎麥蛋白的溶解性在不同pH 條件下處理制得的曲線基本為“V”字形，即在等電點(diǎn)附近溶解度最低，在堿性和偏酸性條件下溶解度較好。阮景軍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥蛋白的溶解性在pH 值＜3.0 以及pH 值＞5.0 時(shí)，其溶解性增加。

由圖1 可知，蕎麥蛋白的溶解度在等電點(diǎn)兩側(cè)呈上升趨勢(shì)，在等電點(diǎn)附近的溶解性較差。pH 值在2～4 時(shí)，蛋白溶解度隨pH 值升高而降低，但在pH值為4.5 時(shí)有小幅度增加，pH 值在4.5～12 時(shí)，蛋白溶解度隨pH 值升高而升高，pH 值在12 時(shí)達(dá)到最大。影響蛋白質(zhì)溶解性的主要因素是分子間的疏水相互作用和氫鍵共同影響的結(jié)果[18]。疏水相互作用使蛋白質(zhì)分子間相互分離，降低了蛋白質(zhì)溶解度；而離子間相互作用則可以促進(jìn)蛋白質(zhì)與溶劑相互作用，使其溶解度提高。在等電點(diǎn)兩側(cè)的pH 值環(huán)境下，溶液中靜電荷總量增加，離子間相互作用明顯，蕎麥蛋白的溶解度達(dá)到最大值；在弱酸環(huán)境下，蛋白質(zhì)在溶劑中的疏水相互作用強(qiáng)于離子作用力，蛋白質(zhì)分子疏水基團(tuán)在外側(cè)，與溶劑中的水分子相互排斥，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度降低。

2.2 離子強(qiáng)度對(duì)蕎麥蛋白溶解度的影響

蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)影響其增稠、起泡、乳化和凝膠等功能特性，且蛋白質(zhì)溶解性會(huì)影響其在食品中的應(yīng)用[19]。從圖2 可以看出，隨著電解質(zhì)氯化鈉的加入，在鹽離子濃度低于0.4 mol/L 時(shí)，蕎麥蛋白的溶解度與鹽離子濃度沒(méi)有線性關(guān)系，較低濃度的鹽離子不足以改變蕎麥蛋白的溶解度；蕎麥蛋白在鹽離子濃度0.4 mol/L 時(shí)溶解度最大，是因?yàn)辂}離子與蛋白質(zhì)分子的親水基團(tuán)相結(jié)合，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)與水分子間的結(jié)合，從而使蕎麥蛋白的溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；當(dāng)鹽離子濃度高于0.4 mol/L時(shí)，蕎麥蛋白溶解度隨鹽離子濃度增大而逐漸降低，這是因?yàn)檫^(guò)高濃度的鹽溶液使得蛋白溶液出現(xiàn)鹽析的現(xiàn)象，并伴隨著蛋白質(zhì)的析出，降低其溶解度。就整體而言，在鹽離子濃度為0～1.0 mol/L 時(shí)，鹽離子濃度對(duì)于蕎麥蛋白的溶解度影響不大，其波動(dòng)范圍只有10%左右[20]。

2.3 pH 對(duì)蕎麥蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

陶健等[21]研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥分離蛋白在堿性條件下有比較好的乳化性，在偏酸性條件下有比較好的乳化穩(wěn)定性。BEJOSANO 等[22]研究表明，蕎麥蛋白具有良好的乳化性。

從圖3 可以看出，在pH 值為2 和12 時(shí)，蕎麥蛋白有較好的乳化性；在pH 值為2～4.5 時(shí)，蕎麥蛋白的乳化性大幅下降；在pH 值為4.5～6 時(shí)，蕎麥蛋白的乳化性呈上升趨勢(shì)；在pH 值為6～7 時(shí)，蕎麥蛋白的乳化性開(kāi)始下降；在pH 值為8～11 時(shí)，蕎麥蛋白的乳化性基本趨于穩(wěn)定；在pH 值為11～12 時(shí)，蕎麥蛋白的乳化性上升到最大值。由于蛋白質(zhì)的乳化能力首先取決于溶解度，溶解度越大，蛋白質(zhì)與油相產(chǎn)生的乳化作用越明顯，其乳化能力也就越大，所以，出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能是因?yàn)閜H 對(duì)蕎麥蛋白溶解度的趨勢(shì)也呈現(xiàn)這樣的變化[23]。試驗(yàn)結(jié)果表明，蕎麥蛋白的乳化穩(wěn)定性隨著其乳化活性的變化而變化，乳化活性越大，乳化穩(wěn)定性越好。

2.4 離子強(qiáng)度對(duì)蕎麥蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

從圖4 可以看出，蕎麥蛋白的乳化活性在離子強(qiáng)度0.01～0.1 mol/L 時(shí)增加，在0.1～0.4 mol/L 時(shí)降低，在0.4～0.6 mol/L 時(shí)增加，在鹽離子濃度高于0.6 mol/L 時(shí)，蕎麥蛋白的乳化活性呈降低趨勢(shì)；蕎麥蛋白的乳化穩(wěn)定性的變化趨勢(shì)與溶解度變化相一致，離子強(qiáng)度在0.3 mol/L 時(shí)表現(xiàn)的乳化穩(wěn)定性最好?？傮w看來(lái)，鹽離子濃度對(duì)蕎麥蛋白的乳化穩(wěn)定性的影響相對(duì)較小。

2.5 不同pH 條件下蕎麥蛋白SDS-PAGE 分析

由圖5 可知，非還原電泳圖譜的濃縮膠和分離膠頂端出現(xiàn)的亞基條帶和分布在43～66.2 ku 范圍內(nèi)的亞基，在還原電泳圖譜中消失，說(shuō)明這些亞基是部分小分子量亞基通過(guò)二硫鍵所形成。還原電泳圖譜中，在31～43 ku 范圍內(nèi)亞基條帶的增加和14.4～22 ku 范圍內(nèi)亞基條帶顏色的加深，說(shuō)明它們通過(guò)分子間或分子內(nèi)二硫鍵形成了分子量較大的可溶性聚集體。無(wú)論是非還原電泳還是還原電泳，圖譜中22～31 ku 范圍的亞基條帶在pH 值6～12范圍內(nèi)，隨pH 值增加而逐漸加深，結(jié)合溶解度曲線（圖1），說(shuō)明這些亞基在堿性環(huán)境中溶解性更好。而還原電泳圖譜中43～66.2 ku 范圍內(nèi)的亞基在酸性條件下顏色很淺，說(shuō)明其在酸性環(huán)境中的溶解度低。由此，說(shuō)明蕎麥蛋白中的部分亞基含有二硫鍵，而且不同pH 環(huán)境中亞基的組成分布有較大差異，這是由亞基溶解度差異導(dǎo)致的。

2.6 不同離子強(qiáng)度條件下蕎麥蛋白SDS-PAGE分析

從圖6 可以看出，隨著離子強(qiáng)度的增加，非還原電泳圖譜中濃縮膠和分離膠頂部亞基條帶逐漸消失，說(shuō)明這部分亞基在高離子強(qiáng)度環(huán)境中溶解度較低。而在還原和非還原電泳圖譜中22～31 ku 范圍的亞基條帶顏色逐漸加深，說(shuō)明這部分亞基在高離子強(qiáng)度環(huán)境中溶解度呈上升趨勢(shì)。由此，說(shuō)明不同離子強(qiáng)度環(huán)境中亞基的組成分布有較大差異，但結(jié)合溶解度曲線可知，亞基分布也造成溶解度的差異。

3 結(jié)論與討論

蕎麥蛋白同其他谷物蛋白相似，均是由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和少量雜蛋白組成。但蕎麥蛋白中清蛋白、球蛋白的含量較多，而醇溶蛋白和谷蛋白含量較少，這使得蕎麥蛋白的組成與豆類(lèi)蛋白相似。本研究通過(guò)堿提酸沉法所得的蕎麥蛋白主要是由清蛋白和球蛋白組成。由試驗(yàn)結(jié)果可知，蕎麥蛋白的溶解特性和功能特性與豆類(lèi)蛋白相似，其等電點(diǎn)在pH 值4～5 范圍內(nèi)，但蕎麥蛋白在高離子強(qiáng)度下的溶解度較好；由電泳分析結(jié)果可知，蕎麥蛋白在不同pH 條件下的亞基分布相似，說(shuō)明亞基溶解特性無(wú)差異性，而離子強(qiáng)度條件下亞基分布略有不同，這說(shuō)明蕎麥蛋白的高鹽溶性是部分亞基造成的。

本研究結(jié)果表明，蕎麥蛋白溶解度在等電點(diǎn)兩側(cè)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)鹽離子濃度為0.4 mol/L 時(shí)溶解度最大，且隨著鹽離子濃度的逐漸增大，其溶解度略有降低，整體而言，離子強(qiáng)度對(duì)于蕎麥蛋白的溶解度影響不大；堿性條件下蕎麥蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性優(yōu)于酸性條件。SDS-PAGE 結(jié)果表明，蕎麥蛋白的亞基主要分布在14.4～97.4 ku 范圍內(nèi)，且部分亞基含有二硫鍵；不同pH 和離子強(qiáng)度條件下蕎麥蛋白亞基的組成有較大差異。