孫文文，柯紅利，阿周存

（1.大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理 671000；2.大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003）

生精障礙是男性不育最常見病因，在其發(fā)病過程中，遺傳因素起著重要作用〔1〕。目前，已發(fā)現(xiàn)一些生精障礙的遺傳病因，但這些已知的遺傳病只能解釋一小部分病例，仍有大量的相關(guān)基因有待進一步闡明〔2〕。作為一類基因表達的重要調(diào)控因子，MicroRNA（miRNA）通過與靶mRNA 的3′-UTRs堿基配對形成雙鏈，介導靶mRNA 裂解或抑制mRNA 翻譯形成蛋白質(zhì)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔3〕。研究表明，miRNA 參與精子發(fā)生過程中許多基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達調(diào)控，其異?？赡軐е律系K〔4-6〕。因此，miRNA 基因也被認為是一類新的生精障礙候選基因，研究鑒定生精障礙相關(guān)的miRNA 基因，對生精障礙遺傳病因的闡明具有重要意義。

miR-27a和miR-605基因是近些年來發(fā)現(xiàn)的與哺乳動物和人類精子發(fā)生密切相關(guān)的miRNA 基因，也被認為是生精障礙和男性不育的重要候選基因〔7-9〕。目前，尚未有miR-27a和miR-605基因的多態(tài)性與嚴重生精障礙的研究報道。本研究在正常男性和嚴重生精障礙患者中，對miR-27a和miR-605基因內(nèi)的常見單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點rs895819 和rs2043556 的多態(tài)性分布進行分析和比較，從基因變異的角度，初步探索miR-27a和miR-605基因與嚴重生精障礙的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象病例組由318例嚴重生精障礙患者組成，包括嚴重少精癥（精子密度小于5×106個∕mL）患者和無精癥患者，病例來自于四川大學華西醫(yī)院和大理大學第一附屬醫(yī)院。對照組包括234例精子密度正常的男性。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器DNA提取試劑盒（TIANGEN公司，批號：DP304）；dNTPs（TaKaRa公司，批號：AJ30388A）；PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）；Taq DNA聚合酶（TaKaRa 公司，批號：DR001AM）；限制性內(nèi)切酶DraⅢ和HinfI（Thermo Fisher 生物公司，批號：ER1231、ER0801）；PCR 擴增儀（Eppendorf 公司，型號：AG 22331 Hamburg）；凝膠電泳儀（Bio-RAD 公司，型號：041BR）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-RAD 公司，型號：Gel Doc100）。

1.3 方法

1.3.1 PCR 擴增 用DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）從200 μL 外周血中提取基因組DNA。miR-27a和miR-605的PCR 擴增引物序列、擴增片段長度、退火溫度見表1。PCR 擴增反應的體積為25 μL，反應條件為：94 ℃預變性5 min，35個循環(huán)（94 ℃變性30 s，57～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s），最后72 ℃延伸5 min。

表1 PCR擴增的引物序列和擴增產(chǎn)物大小，RFLP分析所用的限制性內(nèi)切酶和等位基因的酶切片段長度

1.3.2 基因分型 利用限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析方法對SNP rs895819和rs2043556進行基因分型。取PCR 產(chǎn)物10 μL，用10 個單位的限制性內(nèi)切酶消化過夜，然后在2%（rs895819）和3%（rs2043556）的瓊脂糖凝膠上進行電泳。所用的限制性內(nèi)切酶、各等位基因的酶切片段見表1。通過對部分不同基因型的部分標本進行PCR 產(chǎn)物直接測序，對電泳分型結(jié)果進行驗證。

1.3.3 統(tǒng)計學分析 計數(shù)計算基因頻率和基因型頻率。用HWE 計算器進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗。采用χ2檢驗比較病例組和對照組之間等位基因和基因型頻率之間的差異，檢驗水準設為P＜0.05。

2 結(jié)果

miR-27a基因的SNP rs895819 等位基因頻率和基因型頻率分布在嚴重生精障礙患者和正常男性之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；miR-605基因的SNP rs2043556 等位基因頻率和基因型頻率分布在嚴重生精障礙患者和正常男性間的差異具有統(tǒng)計學意義，嚴重生精障礙患者中rs2043556 的等位基因C 的頻率（36.2%vs.29.1%，P=0.013，OR=1.383，95%CI為1.070～1.788）和帶有等位基因C 的個體（TC∕CC）的頻率（57.2%vs.48.3%，P=0.037，OR=1.433，95%CI為1.021～2.012）顯著高于正常男性，而TT 基因型的頻率（42.8%vs.51.7%，P=0.037，OR=0.698，95%CI為0.497～0.980）則顯著低于正常男性。見表2。

表2 對照組和病例組SNP rs895819 和rs2043556的等位基因頻率和基因型頻率分布

Hardy-Weinberg 平衡檢驗結(jié)果顯示，SNP rs895819 和rs2043556 的基因型分布在嚴重生精障礙患者和正常男性中符合Hardy-Weinberg 平衡，提示本研究的研究對象具有群體代表性。

SNP rs895819 和rs2043556 的電泳分型結(jié)果與測序結(jié)果一致，表明本研究RFLP 分型的結(jié)果準確、可靠。見圖1。

圖1 SNP rs895819和rs2043556的電泳分型結(jié)果

3 討論

本研究對生精障礙的候選基因miR-27a和miR-605的常見SNP rs895819 和rs2043556 的多態(tài)性與嚴重生精障礙的相關(guān)性進行了調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示，miR-27a基因的SNP rs895819 的等位基因頻率和基因型頻率分布在嚴重生精障礙患者和正常男性間差異無統(tǒng)計學意義，提示SNP rs895819 的多態(tài)性與嚴重生精障礙不相關(guān)。然而，在miR-605基因的SNP rs2043556位點上，嚴重生精障礙患者的等位基因C 頻率和帶有等位基因C 的個體（TC∕CC）的頻率顯著高于正常男性，基因型TT的頻率則顯著低于正常男性。這些結(jié)果表明，SNP rs2043556的多態(tài)性與嚴重生精障礙相關(guān)聯(lián)，基因型TT是嚴重生精障礙的保護性基因型（降低發(fā)病風險），而等位基因C可能增加嚴重生精障礙的發(fā)病風險。

上述結(jié)果顯示，SNP rs2043556 影響嚴重生精障礙的發(fā)病風險，但具體原因尚未清楚。SNP rs2043556 是一個位于pre-miR-605結(jié)構(gòu)區(qū)域的C∕T變異。該變異影響轉(zhuǎn)錄后pre-miR-605的加工效率，進而影響成熟miR-605的表達水平。與等位基因T 相比，等位基因C 的miR-605表達水平顯著降低〔10〕。有研究顯示，miR-605能在mRNA 水平和蛋白水平抑制靶基因MDM2表達，其表達水平降低將導致MDM2過表達〔10-12〕。MDM2基因是一個在生精過程中發(fā)揮重要作用的基因，其過表達可能會對正常的生精功能造成較大的影響，導致生精障礙，如無精癥和嚴重少精癥〔13-14〕。因此，SNP rs2043556通過影響miR-605的表達水平，進而引起miR-605一些在生精過程中有重要作用的靶基因的表達異常，最終影響正常的生精功能，導致生精障礙。這可能是SNP rs2043556 影響嚴重生精障礙發(fā)病風險的原因之一。

本研究首次對miR-27a和miR-605基因的常見SNP rs895819 和rs2043556 多態(tài)性與嚴重生精障礙的關(guān)系進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)miR-605的SNP rs2043556的多態(tài)性與嚴重生精障礙相關(guān)，其變異影響嚴重生精障礙的發(fā)病風險，提示miR-605可能參與生精障礙的病理過程。研究結(jié)果有可能為生精障礙的遺傳病因?qū)W提供有價值的參考。