李圣琦 楊 崢 吳林秀

(1 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術學院醫(yī)學系，南寧市 530023，電子郵箱：22535821@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，南寧市 530021)

隨著人們生活水平的提高，飲食豐盛和運動缺乏使得2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)已經逐漸成為影響國民健康的主要因素，僅次于心腦血管疾病與惡性腫瘤[1-2]。有數據顯示，中國T2DM的患病率約11%，60歲以上的老年人糖尿病患病率在20%以上[3]。糖尿病能夠引發(fā)一系列嚴重并發(fā)癥，進一步影響人們的生活質量。目前雖有很多關于T2DM遺傳方面的發(fā)病機制的研究報道，但仍需進一步探討。

近年來，隨著微陣列技術的廣泛應用，越來越多研究者利用高通量的表達譜分析平臺檢測各種疾病中基因的表達差異，來分析疾病發(fā)展過程中遺傳變異的情況[4]。盡管在過去的幾十年，對T2DM的機制研究越來越清晰，并且已經有相關研究利用表達譜技術分析相關基因在T2DM中的作用[5]，但是關于差異基因和微小RNA(microRNA,miRNA)通過何種分子途徑相互作用，卻鮮有研究報道。因此，我們利用生物信息學方法分析T2DM中差異表達的信使RNA(message RNA,mRNA)和miRNA之間的相互作用，特別是相互作用網絡中的路徑，以總結關鍵mRNA和miRNA在T2DM中的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 mRNA和miRNA基因芯片表達譜數據的收集 通過公開的GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索與T2DM相關的研究，獲得兩個基因表達譜數據集(GSE76895和GSE27645)進行分析。每個數據集均含有T2DM組織樣品和正常組織樣品，其中GSE76895包含36例T2DM患者、32例正常人以及15例糖耐量受損患者的胰島組織芯片數據，GSE27645包含14例T2DM患者以及10例正常人外周血miRNA譜芯片數據。

1.2 差異表達mRNA和差異表達miRNA的篩選 利用交互式在線分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析并篩選T2DM和正常組織樣品之間差異表達的mRNA和miRNA[6]。為了防止假陽性結果的發(fā)生，在GEO2R分析中。差異基因設置標準為校正后P值<0.05和|logFC|≥1。

1.3 差異表達mRNA的功能和途徑富集分析 利用在線工具DAVID[7](https://david.ncifcrf.gov/)和PANTHER[8](http://www.pantherdb.org/)分別對差異表達的mRNA進行基因本體論(Gene Ontology,GO)和通路富集分析。以P值<0.05為標準。

1.4 蛋白質相互作用網絡的構建 利用STRING(http://string-db.org/)在線分析軟件，將差異表達的mRNA進行映射獲得蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡[9]，然后使用Cytoscape進行可視化[10]。

1.5 miRNA靶標的預測、mRNA-miRNA網絡的構建與模塊分析 利用在線工具miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)預測來自GSE27645的差異表達miRNA的靶基因[11]。將差異表達miRNA的靶基因與差異表達mRNA進行比對以獲得用于進一步分析的交集，獲得miRNA-mRNA相關對列，采用Cytoscape繪制miRNA-mRNA網絡圖。最后通過FunRich軟件[12]預測與差異表達miRNA相互作用的轉錄因子。

2 結 果

2.1 差異表達mRNA和差異表達miRNA的篩選結果 數據集GSE76895中，與正常人相比，T2DM患者有40個差異表達mRNA，其中表達上調的mRNA共23個，表達下調的mRNA共17個，見圖1A及表1；其中與免疫相關的mRNA包括SCTR、TSHR、ARG2、FAM19A4、CALCA、SPP1，見表2。數據集GSE27645中，與正常人相比，T2DM患者有67個差異表達miRNA，其中表達下調的miRNA共66個，表達上調的miRNA共1個，見圖1B及表1。

圖1 差異表達mRNA和miRNA火山圖

表1 數據集GSE76895與GSE27645的差異基因

表2 與免疫相關的差異表達mRNA

2.2 差異表達mRNA的功能和通路富集分析 GO富集分析表明，差異表達mRNA的蛋白產物在生物過程相關類別中與成人運動行為、pH調節(jié)相關，蛋白產物部分位于細胞膜、細胞外酶，分子功能主要涉及蛋白質二聚活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，見表3。通路分析結果顯示，差異表達mRNA共富集于12個通路，包括膽囊收縮素受體(cholecystokinin receptor,CCKR)信號通路、鈣黏著蛋白信號通路、果糖半乳糖代謝信號通路、γ-氨基丁酸合成信號通路、糖酵解信號通路、亨廷頓病相關信號通路、離子型谷氨酸受體途徑、Ⅰ組代謝型谷氨酸受體信號通路、Ⅲ組代謝型谷氨酸受體信號通路、毒蕈堿型乙酰膽堿受體1和3信號通路、Toll 受體信號通路、Wnt信號通路。

表3 差異表達mRNA的GO分析結果

2.3 PPI網絡 利用已識別的差異表達mRNA繪制了43個節(jié)點(3個為新增預測的其他相關蛋白)和33個邊緣的PPI網絡，平均節(jié)點度為1.44，平均局部聚類系數為1.6e-05。利用MCODE插件篩選出K值較高的前3個節(jié)點作為網絡中關鍵核心基因，分別為SCTR、TSHR、CALCA。 見圖 2。

圖2 差異表達基因蛋白PPI網絡及核心基因注：圖A為差異表達mRNA的PPI網絡； 圖B為PPI網絡中展示的核心基因，其中紅色為上調的基因，綠色為下調的基因。

2.4 miRNA-mRNA網絡以及與miRNA相互作用的潛在轉錄因子 針對GSE27645數據集獲得的差異表達miRNA，使用miRDB數據庫預測共獲得19 414個靶基因。通過將差異表達miRNA的靶基因與差異表達mRNA進行比較，取交集后得到37個miRNA-mRNA負相關對列，利用Cytoscape繪制miRNA-mRNA網絡圖(圖3A)。其中，miRNA-16-5p是表達下調最明顯的miRNA之一，其靶向丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)；同時，PDK4可能被3種miRNA靶向調控，包括miRNA-103a-3p、miRNA-107、miRNA-15b-5p。通過FunRich軟件預測與差異表達miRNA相互作用的轉錄因子，發(fā)現轉錄因子SP1、早期生長應答因子(early growth response 1,EGR1)是最顯著的潛在靶標，見圖3B。

圖3 差異表達mRNA的通路分析結果

圖3 miRNA-mRNA網絡圖及miRNA相關轉錄因子注：圖A為miRNA-mRNA網絡圖，其中圓圈表示mRNA，三角形表示miRNA，紅色表示上調，綠色表示下調； 圖B為miRNA相關轉錄因子。

3 討 論

T2DM是影響國民健康水平的主要疾病，盡管針對糖尿病的研究受到了廣泛的關注，但涉及驅動T2DM發(fā)生和發(fā)展的重要基因和途徑有待進一步研究，對T2DM的早期診斷和基因治療仍是目前亟待解決的問題。微陣列技術的成熟應用使得確定疾病中的遺傳改變變得更加簡便，從而可以用于相關疾病的靶標基因篩選。因此，本文利用微陣列獲得的表達譜數據對T2DM發(fā)生的因素和機制進行深入研究。

在本研究中，共篩選出40個差異表達的mRNA，包括23個表達上調基因和17個表達下調基因；GO富集分析表明，這些差異表達mRNA的蛋白產物在生物過程相關類別中與成人運動行為、pH調節(jié)等相關，主要涉及的通路有CCKR信號通路、鈣黏著蛋白信號通路、果糖半乳糖代謝、γ-氨基丁酸合成、糖酵解等。其中與免疫相關的mRNA包括SCTR、TSHR、ARG2、FAM19A4、CALCA、SPP1。通過構建PPI網絡，我們鑒定出3個核心基因，包括表達下調的SCTR，以及表達上調的TSHR、CALCA。(1)SCTR是胰高血糖素受體家族的成員。SCTR蛋白定位在胰管和膽管內的上皮細胞上，其與特異性促胰液素結合，參與不同的生物過程[13]。近期，有學者提出一種新觀點，即SCTR在飲食誘導的熱生成中也起著核心作用：充當介導餐前熱生成的非交感性棕色脂肪活化劑，從而引起飽食感；飯后腸道釋放的促胰液素與棕色脂肪細胞中的SCTR結合，通過刺激脂解作用來激活棕色脂肪的生熱作用，這種作用在大腦中被感知并促進飽食感[14]。由此推測，SCTR可能影響消化生物過程和脂肪分解代謝途徑，SCTR的下調導致飯后飽食感下降，在T2DM的發(fā)生中發(fā)揮作用。(2) TSHR 是一種蛋白質編碼基因，與甲狀腺功能減退、甲狀腺功能亢進、家族性妊娠疾病等疾病相關。TSHR是由α和β兩個亞基組成的蛋白質，它們的激活導致細胞內腺苷酸環(huán)化酶水平的增加。TSHR屬于G蛋白偶聯受體，與酪氨酸激酶受體之間存在交互作用，有研究表明TSHR與胰島素受體通路之間存在樞紐—胰島素受體底物1，且具有胰島素抵抗的患者表達異常磷酸化的胰島素受體底物1，這阻礙了胰島素受體依賴性信號傳導級聯反應[15]。由此推測，TSHR的上調導致胰島素受體底物1異常磷酸化，導致胰島素抵抗發(fā)生，從而在T2DM的發(fā)生中發(fā)揮作用。(3)CALCA是一種蛋白質編碼基因，與CALCA相關的疾病包括反射性交感神經營養(yǎng)不良和椎管狹窄。目前關于CALCA與T2DM的相關性研究較少。有研究表明，T2DM小鼠模型中CALCA啟動子目標片段中的DNA甲基化水平上調，從而降低從T2DM小鼠模型中提取而來的脂肪來源干細胞中CALCA的表達[16]。這一研究結果與本研究結果不符，有待進一步行基因檢測證實CALCA與T2DM發(fā)生的相關性。

miRNA是非編碼RNA，其主要通過miRNA的5′UTR與RNA靶序列的3′UTR結合，從而導致RNA靶序列降解或翻譯抑制[17]。研究表明，miRNA的失調是多種疾病發(fā)病機理的重要組成部分[18]。本研究在T2DM中鑒定出67個差異miRNA，包括66個下調的miRNA和1個上調的miRNA。miRNA-mRNA網絡分析結果顯示，miRNA-16-5p是下調最明顯的miRNA之一，其靶向調控丙酮酸脫氫酶。丙酮酸脫氫酶是丙酮酸脫氫酶/支鏈酮酸脫氫酶激酶蛋白激酶家族的成員，是具有組氨酸激酶結構域的線粒體蛋白。該蛋白位于線粒體的基質中，PDK4通過丙酮酸脫氫酶亞基A1和A2的磷酸化，抑制丙酮酸脫氫酶復合物形成，從而在葡萄糖、脂肪酸代謝和體內穩(wěn)態(tài)的調節(jié)中起關鍵作用[19]。研究表明，PDK4參與胰島素信號的級聯反應，通過對丙酮酸脫氫酶活性的調節(jié)，在維持正常的血糖水平、血液pH值和酮體，以及調節(jié)脂肪酸氧化和生物合成中起重要作用[20]。此外，還有研究顯示，肥胖和T2DM患者肌肉組織中的PDK4 mRNA表達增加，從而影響胰島素生成[21]。2008年，Rasche等[22]對人類和小鼠中多個組織的213個T2DM基因集進行了薈萃分析，同樣發(fā)現PDK4參與了T2DM的發(fā)生。以上發(fā)現與我們預測的結果相一致。

此外，miRNA-mRNA網絡分析結果顯示，miRNA-103a-3p、miRNA-107與miRNA-15b-5p可能起到協同靶向PDK4的作用。最近有學者在關于肥胖患者手術前后miRNA的差異研究中，同樣鑒定出了miRNA-16-5p作為調控網絡中的重要一員[23]。Tang等[24]首先將miRNA-107與糖尿病和葡萄糖代謝聯系起來，提出miRNA-107的失調可以導致炎癥、肥胖與胰島素抵抗的發(fā)生。另外，一項針對miRNA與T2DM的研究也表明，miRNA-107在肥胖癥和T2DM患者中表達明顯失調[25]。由此可見，miRNA-16-5p、miRNA-103a-3p、miRNA-107與miRNA-15b-5p等miRNA可能在T2DM的病理生理過程中起到關鍵作用。

總之，通過全面的生物信息學分析，共篩選出了與T2DM有關的40個差異表達mRNA和67個差異表達miRNA，其中核心基因SCTR、TSHR、CALCA，以及miRNA-16-5p、miRNA-103a-3p、miRNA-107與PDK4的調控網絡，可能為T2DM的診斷和治療提供新的線索。