李興艷 楊業(yè)靜 黃家志 代萬武 黃祖權(quán) 杜勇軍

(廣西醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，南寧市 530031，電子郵箱：448445226@qq.com)

脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離出的一種具有多向分化潛能的干細胞，主要具有恢復組織細胞、促進細胞再生的作用，可有效改善亞健康、早衰等疾病，抵抗衰老[1]。此外，ADSCs因其具有來源充足、取材容易等優(yōu)點，已成為骨組織工程研究的熱點。但ADSCs成骨分化的分子生物學機制目前仍未完全闡明[2]。隨著大數(shù)據(jù)及生物信息學的快速發(fā)展，以及ADSCs在臨床醫(yī)學領(lǐng)域的應用[3]，已有一些學者針對ADSCs成骨分化進行了RNA芯片及測序研究，以進一步探討這些RNA在ADSCs成骨分化過程中所發(fā)揮的分子生物學機制。因此，本研究應用生物信息學方法篩選ADSCs成骨分化過程中的差異表達基因及其涉及的信號通路，以探討ADSCs成骨分化過程中潛在的關(guān)鍵基因所發(fā)揮的分子生物學機制。

1 材料和方法

1.1 基因表達譜芯片的搜索 利用NCBI平臺下的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，檢索與ADSCs成骨分化相關(guān)的基因數(shù)據(jù)集，在檢索結(jié)果中選擇GSE63754[4]數(shù)據(jù)進行挖掘。GSE63754是由國外學者使用Agilent-039494 SurePrint G3 Human GE v2 8x60K Microarray 039381探針測定6個ADSCs成骨分化相關(guān)樣本的mRNA表達譜，包括3個ADSCs樣本和3個成骨細胞樣本[5]。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異表達基因分析 對數(shù)據(jù)進行整理及優(yōu)化，如出現(xiàn)同名基因不同表達量時取均值，同時將數(shù)據(jù)進行對數(shù)變換(log2)使得數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布。隨后將數(shù)據(jù)分為成骨細胞組(實驗組)和ADSCs組(對照組)，利用R語言的Limma軟件包(版本號：3.12)對數(shù)據(jù)進行歸一化處理后進行差異表達基因分析。選取adjP值<0.05、|logFC|>2的基因作為候選差異表達基因。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)錄因子預測 將差異表達基因所對應的蛋白上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(版本號：11.0)，選取打分值(基因或者蛋白之間最低互動得分)>0.4的數(shù)據(jù)，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡，并利用Cytoscape軟件(版本號：v3.7.1)將PPI網(wǎng)絡可視化。同時，使用iRegulon軟件(版本號：1.3)對PPI網(wǎng)絡內(nèi)的基因進行轉(zhuǎn)錄因子富集預測，將標準化富集分數(shù)(normalized enrichment score，NES)排名前5的轉(zhuǎn)錄因子進行可視化。

1.4 關(guān)鍵基因的篩選 為了進一步篩選與ADSCs成骨分化過程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因，使用cytoHubba插件(版本號：v3.7.1)中的Degree算法對PPI網(wǎng)絡進行重要模塊分析。選擇Degree排名前6的基因作為與ADSCs成骨分化過程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因的功能和通路富集分析 采用clusterProfiler包(版本號：3.12)對關(guān)鍵基因進行基因本體論(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析。根據(jù)adjP值<0.05進行篩選。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)預處理及差異分析 將GSE63754數(shù)據(jù)預處理后各基因的表達均一化(見圖1A和圖1B)，得到32 055個基因的表達矩陣(圖2)。經(jīng)過差異表達基因分析后，篩選出556個差異表達基因，其中228個基因在成骨細胞組處于上調(diào)水平，而另228個基因在ADSCs組處于下調(diào)水平。在這些差異表達基因中選取上下調(diào)最明顯的100個基因(在ADSCs成骨分化過程中50個上調(diào)的基因和50個下調(diào)的基因)繪制熱圖(見圖2)。

圖1 數(shù)據(jù)預處理結(jié)果注：A為預處理前的數(shù)據(jù)表達情況；B為處理后的基因表達情況，可知數(shù)據(jù)處于同一水平線，代表處理后的數(shù)據(jù)佳。

圖2 差異表達基因分析結(jié)果注：A為火山圖，紅色代表在成骨細胞中上調(diào)，藍色代表在成骨細胞中下調(diào)；B為熱圖，紅色代表在成骨細胞中上調(diào)，綠色代表在成骨細胞中下調(diào)。

2.2 PPI網(wǎng)絡及轉(zhuǎn)錄因子 通過STRING 11.0在線網(wǎng)絡工具對556個差異基因進行PPI網(wǎng)絡分析，排除242個無相互作用的蛋白，最后得到由314個節(jié)點、852條連接構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡圖。通過iRegulon插件對這些PPI網(wǎng)絡里的基因進行轉(zhuǎn)錄因子預測，構(gòu)建PPI和轉(zhuǎn)錄因子預測網(wǎng)絡，預測出5個轉(zhuǎn)錄因子，包括ESRP1、PRKAA2、POU5F1B、ATF4HE和ZSCAN4(見圖3)，圖中的蛋白與其他節(jié)點連線越多，表明該蛋白在該網(wǎng)絡中越重要。

2.3 關(guān)鍵基因的篩選 Degree排名前6的關(guān)鍵基因分別是瘦素(leptin, LEP)、白細胞介素1β(interleukin 1β,IL1B)、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)、鈣黏蛋白1(cadherin 1,CDH1)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)和過氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)(見圖3)。

圖3 PPI網(wǎng)絡和轉(zhuǎn)錄因子預測圖注：圓形代表基因，八邊形代表轉(zhuǎn)錄因子，線條代表相互關(guān)聯(lián)

2.4 功能和通路富集分析結(jié)果 LEP、IL1B、FGF2、CDH1、VEGFA和PPARG這6個關(guān)鍵基因主要富集在p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，并且可能與破骨細胞分化相關(guān)。見圖4。

圖4 ADSCs成骨分化過程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因的富集分析注：A為關(guān)鍵基因的GO富集分析圖(前30);B為關(guān)鍵基因的KEGG信號通路富集分析圖(前30);C為關(guān)鍵基因的GO富集分析結(jié)果中排名前10的GO條目;D為關(guān)鍵基因的KEGG富集分析結(jié)果中排名前10的信號通路。

3 討 論

本研究共篩選出556個差異表達基因。最終發(fā)現(xiàn)LEP、IL1B、FGF2、CDH1、VEGFA和PPARG為ADSCs成骨分化過程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因，并且這些基因和信號通路主要富集在p38 MAPK信號通路上，可能與破骨細胞分化相關(guān)。

PPARG為過氧化物酶體增生激活受體γ的編碼基因，其編碼的過氧化物酶體增生激活受體γ可以與類維生素A受體結(jié)合形成二聚物，該二聚體可以與多種基因的特異DNA序列——過氧化物酶體增殖反應元件(peroxisome proliferators response element，PPRE)結(jié)合，從而激活基因的表達。PPARG主要與癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病和肥胖癥相關(guān)[6]，但尚未見有關(guān)PPARG調(diào)控細胞分化的研究。本研究結(jié)果表明PPARG可能是ADSCs成骨細胞分化過程中的潛在關(guān)鍵分子，但這只是通過生物信息學方法預測的結(jié)果，還有待體內(nèi)外實驗的進一步驗證。

CDH1[7]、VEGFA[8]、FGF2[9]都是癌基因。CDH1基因編碼E-鈣黏蛋白，是一種鈣依賴性細胞黏附蛋白，屬于鈣黏蛋白家族成員，CDH1基因參與調(diào)節(jié)細胞黏附、遷移和上皮細胞增殖，其功能缺失導致細胞更容易侵襲和轉(zhuǎn)移，該基因的突變與胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌和卵巢癌密切相關(guān)[10]。VEGFA基因是血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)/血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族的成員，是糖基化的有絲分裂原，除可特異性地作用于內(nèi)皮細胞外，還具有多種作用，包括介導增加的血管通透性、誘導血管生成、血管發(fā)生和內(nèi)皮細胞生長、促進細胞遷移和抑制細胞凋亡，其主要與糖尿病及動脈粥樣硬化等微血管病變相關(guān)[11]。FGF2基因編碼的蛋白是成纖維細胞生長因子家族的成員，具有廣泛的促有絲分裂和血管生成活性，該蛋白與多種生物學過程有關(guān)，如肢體和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、傷口愈合和腫瘤生長等。

值得注意的是，IL1B[12]、LEP[13]與炎癥相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，兩者是與ADSCs的成骨分化相關(guān)的潛在關(guān)鍵分子。因此，IL1B和LEP調(diào)控的炎癥反應是否也參與了ADSCs的成骨分化有待進一步研究。

MAPK是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其能將信號從細胞外表面?zhèn)鲗У郊毎说膬?nèi)部，能被不同的細胞外因子刺激所激活，如細胞黏附因子、神經(jīng)遞質(zhì)因子、生長因子等。MAPK通路是一種較為保守的三級激酶模式，依次通過MAPK激酶激酶、MAPK激酶和MAPK激活下游信號，共同調(diào)節(jié)著細胞的炎癥反應、對環(huán)境的應激適應、分化和生長等多種重要的細胞生理或病理生理過程。在調(diào)控細胞炎癥反應方面，p38 MAPK在重癥胰腺炎炎癥反應中扮演重要角色[14]；而在調(diào)控細胞生長、分化方面，p38 MAPK能夠促進小鼠成骨細胞增殖、分化并抑制成骨細胞的凋亡[15]。本研究結(jié)果表明，p38 MAPK信號通路可能在ADSCs成骨分化的分子生物學過程中發(fā)揮著重要的作用，這與MAPK信號通路參與細胞生長、分化的作用一致。

綜上所述，本研究通過對GEO 數(shù)據(jù)庫中關(guān)于ADSCs成骨分化的相關(guān)數(shù)據(jù)進行挖掘，發(fā)現(xiàn)ADSCs成骨分化過程中潛在的關(guān)鍵基因及其涉及的通路。這或可為今后進一步開展實驗研究，探索ADSCs成骨分化的發(fā)生、發(fā)展及分子生物學機制提供新的思路和依據(jù)。