米垚川， 溫濱紅

遼寧省人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 110016

成人的血管平滑肌細胞的主要功能是維持血管收縮并控制血管直徑，以調(diào)節(jié)血壓的血流分布[1-2]。收縮表型的血管平滑肌細胞表達分化標志物如α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，是血管平滑肌細胞維持收縮表型的必需蛋白[3]。當受到高糖、高血脂及高血壓等病理因素刺激時，血管平滑肌細胞表現(xiàn)出顯著可塑性，從收縮型向合成型轉變，其特征是收縮型蛋白的表達降低以及合成型蛋白的表達增加[4-5]。血管平滑肌細胞的表型轉換與動脈粥樣硬化的發(fā)病有關，后者為2型糖尿病的重要并發(fā)癥之一[6]。瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是一種配體門控非選擇性陽離子通道蛋白，對Na+，Ca2+和Mg2+等離子具有顯著的通透性[7]。在改善動脈粥樣硬化方面，TRPV1發(fā)揮至關重要的調(diào)節(jié)作用[8-9]。但目前關于TRPV1是否影響由高糖誘導的血管平滑肌細胞表型轉換鮮有報道?；诖?，本研究以期通過實驗闡明TRPV1對血管平滑肌細胞表型轉換的作用與機制?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 健康8周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠20只，購自維通利華實驗動物技術有限公司，體質(zhì)量(23.00±0.23)g。實驗動物飼養(yǎng)及取材均嚴格遵守實驗動物管理及保護相關規(guī)定。

1.2 主要材料及試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Invitrogen公司；青鏈霉素混合液、胎牛血清購自Gibco公司；葡萄糖試劑購自Sigma公司；TRPV1、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、α-SMA抗體均購自Abcam公司；過表達腺病毒載體AdTRPV1(病毒滴度為1.4×1010PFU/ml)、陰性對照腺病毒載體AdGFP購自和元生物技術股份有限公司。

1.3 原代血管平滑肌細胞分離和培養(yǎng) 組織貼塊法培養(yǎng)小鼠原代血管平滑肌細胞：小鼠麻醉后處死，置入酒精缸中消毒3 min，后置于無菌手術臺，充分顯露胸腹部后用眼科剪切開皮膚；打開胸腔，選取主動脈弓到腹主動脈的血管，PBS反復沖洗后，去除血管外的結締組織及脂肪組織，并在剪開血管后刮除內(nèi)皮細胞；再次PBS沖洗，將剩余的血管剪成約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，將組織塊平均分布在培養(yǎng)皿底部，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基4 ml，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中；4～6 h后翻轉培養(yǎng)瓶，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基8 ml，靜置培養(yǎng)4～5 d，每3 d換液1次，觀察血管平滑肌細胞從組織塊遷出的情況并傳代培養(yǎng)。取第3代以后血管平滑肌細胞種植于6孔板中，分別轉染AdTRPV1或AdGFP，24 h后于熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.4 劃痕實驗 細胞轉染成功后，利用2.5 μl移液器槍頭垂直均勻劃痕，后采用2.0 ml PBS清洗。實驗細胞通過給予25 mmol/L葡萄糖持續(xù)48 h形成高糖刺激；通過給予5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇持續(xù)48 h形成對照。即血管平滑肌細胞轉染AdTRPV1或AdGFP后，再通過高糖刺激或?qū)φ仗幚?，最終分為4組：AdTRPV1對照組、AdGFP對照組、AdTRPV1+高糖組與AdGFP+高糖組。分別于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)0、24 h后，顯微鏡下觀察并拍照記錄。每次顯微鏡觀察前用無血清培養(yǎng)基清洗，除去細胞碎片。根據(jù)公式：細胞遷移率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%，計算細胞遷移率。

1.5 Western blotting法檢測TRPV1及相關表型轉換蛋白表達 血管平滑肌細胞經(jīng)過處理后，將細胞從培養(yǎng)皿底部刮下，轉移至EP管中，加入裂解液，提取細胞蛋白并進行定量，計算并配置相應的上樣量，通過10% SDS-PAGE凝膠行蛋白電泳，蛋白分離后常規(guī)轉膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，第2天TBST洗滌3次，加入對應的二抗后室溫孵育2 h，TBST洗滌4次，采用Amersham Imager 680化學發(fā)光成像儀掃描并記錄分析條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞遷移率比較 AdGFP對照組與AdTRPV1對照組遷移率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AdGFP+高糖組的遷移率明顯高于AdGFP對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AdTRPV1+高糖組的遷移率明顯低于AdGFP+高糖組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 劃痕實驗檢測TRPV1對血管平滑肌細胞在高糖刺激下的遷移率影響

2.2 各組細胞中TRPV1及表型轉換相關蛋白表達比較 AdTRPV1對照組與AdGFP對照組的TRPV1、α-SMA和OPN表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AdGFP+高糖組的TRPV1、α-SMA表達低于AdGFP對照組，OPN表達高于AdGFP對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AdTRPV1+高糖組的α-SMA表達高于AdGFP+高糖組，OPN表達低于AdGFP+高糖組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blotting檢測表型轉換相關蛋白OPN、α-SMA及TRPV1表達(a.電化學發(fā)光法顯示蛋白印跡；b.相對蛋白含量量化分析)

3 討論

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，與非糖尿病相比，糖尿病患者合并心血管疾病的比例顯著升高。既往研究表明，在高糖刺激下，血管平滑肌細胞由收縮表型轉化為合成表型，并導致動脈粥樣硬化等病理現(xiàn)象的發(fā)生與發(fā)展[10]。有研究表明，應用白細胞介素-6單克隆抗體Tocilizumab可抑制高糖引起的血管平滑肌細胞表型轉換，并產(chǎn)生抗動脈粥樣硬化的效應[11]。另一項國外研究表明，MiR-381-3p通過靶向HMGB1，抑制了由高糖刺激引起的血管平滑肌細胞表型轉換[12]。然而，目前臨床措施干預由高糖引起的多種血管疾病效果欠佳。因此，尋找有效的干預靶點，抑制血管平滑肌細胞在高糖刺激下發(fā)生表型轉換，進而減少心血管并發(fā)癥至關重要。

TRPV1在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。有研究表明，TRPV1激活顯著降低自發(fā)性高血壓小鼠來源的血管平滑肌細胞中磷脂酰肌醇3-激酶的活性和蛋白激酶B的磷酸化水平，減輕顱內(nèi)小動脈重塑[13]。本研究結果顯示，AdGFP+高糖組的遷移率明顯高于AdGFP對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AdTRPV1+高糖組的遷移率明顯低于AdGFP+高糖組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此可見，TRPV1對由高糖誘導的血管平滑肌細胞遷移率的增加具有重要調(diào)控作用。本研究結果還顯示，AdGFP+高糖組的TRPV1、α-SMA表達低于AdGFP對照組，OPN表達高于AdGFP對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AdTRPV1+高糖組的α-SMA表達高于AdGFP+高糖組，OPN表達低于AdGFP+高糖組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此可見，TRPV1可逆轉由高糖誘導的血管平滑肌細胞收縮型蛋白標志物水平的下降，同時抑制血管平滑肌細胞向分泌表型轉換。

綜上所述，血管平滑肌細胞在高糖誘導下，TRPV1表達下調(diào)，血管平滑肌細胞由收縮型轉化為分泌型，平滑細胞發(fā)生表型轉換，過表達TRPV1可改善由高糖誘導的血管平滑肌細胞表型轉換。