徐 瑩， 呂東陽， 任 雪， 閻 英， 李 玲

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院1.放射治療科；2.婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110016

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一[1]，放療是肺癌的主要治療手段[2]。然而，仍有部分患者放療療效不理想，出現(xiàn)腫瘤放射線抵抗。因此，對肺癌放射抵抗機制的研究成為了放療領域的研究熱點。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)存在于90%的惡性腫瘤中，端粒是真核細胞染色體末端發(fā)現(xiàn)的一種特殊的DNA-蛋白質(zhì)復合體，端粒穩(wěn)態(tài)與放射敏感性密切相關，增加放射敏感性有助于控制腫瘤的生長速度[3]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是在哺乳動物中廣泛存在的一種豐富的染色質(zhì)相關蛋白，參與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，其高水平表達與臨床預后不良相關[4]。有研究表明，HMGB1對hTERT活性沒有影響，改變HMGB1的表達不會導致染色質(zhì)結(jié)構的任何明顯變化[5]。另有研究表明，HMGB1基因在小鼠胚胎成纖維細胞中的沉默導致hTERT活性下降及端粒功能障礙，而HMGB1過表達則增強了hTERT活性[6]。目前，HMGB1基因沉默是否下調(diào)hTERT表達，以及是否提高腫瘤的放療敏感性尚未清楚。本研究旨在探討HMGB1沉默對hTERT的抑制作用，以及其與肺癌放療敏感性的關系?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 將肺癌細胞系(H-1299)和正常肺泡上皮細胞(BEAS-2B)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)處理方式不同將細胞分為對照組(無X射線照射，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒)，HMGB1 KO組(轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA，敲除HMGB1)，KO+5 Gy組(轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA，敲除HMGB1，照射劑量5 Gy)，KO+10 Gy組(轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA，敲除HMGB1，照射劑量10 Gy)。

1.2 構建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系 選擇針對HMGB1的人shRNA 5‘-GCTCAAGGAGAAT TTGTAA-3’，該序列與3’端結(jié)合作用最強，然后以與人類基因同源性有限且打亂的人shRNA序列5‘-GCTGGAGCAGTCCGATC-3’作為陰性對照。合成shRNAs，將其亞克隆至pGPU6/GFP/Neo shRNA載體，構建成重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA載體。將得到的載體命名為pGPU6/GFP/Neo-HMGB1和pGPU6/GFP/Neo-shNC。用600 g/ml G418篩選HMGB1低表達細胞和陰性對照細胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系分別命名為H-1299-shHMGB1和H-1299-NC。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 用脂質(zhì)體2000對人HMGB1 shRNA和陰性對照shRNA進行細胞轉(zhuǎn)染，操作過程按說明書進行。將病毒濃縮液與食管癌細胞共培養(yǎng)，光學顯微鏡下觀察細胞熒光，證實轉(zhuǎn)染成功。序列如下：HMGB1-shRNA正義，5‘-GGGAGGAGCAUAA GAAGAATT-3’和反義，5‘-UUCUUCUUAUGCUCCUCCUCTT-3’，NC shRNA正義，5‘-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’和反義5‘-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.4 細胞系培養(yǎng)與X射線照射 肺癌細胞系(H-1299)和H-1299-shHMGB1細胞系在RPMI-1640培養(yǎng)基中加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素培養(yǎng)。細胞保存在CO2孵箱中(37℃，CO2濃度5%)。用6 MV西門子直線加速器照射腫瘤細胞，源皮距離100 cm，劑量220 Gy/min。

1.5 HMGB1 mRNA表達檢測 從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在42℃下反應10 min，然后在95℃下反應2 min。根據(jù)Takara 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒說明進行重復PCR反應操作。樣品在95℃預孵育30 s，然后95℃預孵育5 s，60℃預孵育15 s，72℃預孵育30 s。HMGB1：5‘-ATATGGCAAAA GCGGACAAG-3’和5‘-GCAACATCACCAATGGACAG-3’。β-肌動蛋白：5‘-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’和5‘-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG CA-3’。所有的操作均至少重復3次。熱擴增在Mx3000P qPCR系統(tǒng)上進行，結(jié)果用MxP3000P分析程序進行分析。

1.6 蛋白免疫印跡法 每500 μl冷的裂解液中加入2 μl蛋白酶抑制劑，混勻后置于冰上備用。將組織剪碎勻漿后，用BCA蛋白測定試劑盒測蛋白濃度。進行轉(zhuǎn)膜，將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫搖床上搖動封閉1.5 h。將一抗用PBST稀釋至適當濃度，4℃孵育過夜后，用PBST在室溫搖床上洗3次，每次10 min。添加二抗室溫下孵育1.5 h后，用PBST在室溫搖床上洗3次，每次10 min。進行化學發(fā)光反應。

1.7 噻唑藍實驗 將細胞接種于96孔板內(nèi)，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，分別于0、24、48、72、96、120 h更換含5 μg/μl 噻唑藍(MTT)溶液的培養(yǎng)液，加入DMSO震蕩、溶解后，測定吸光度值。

1.8 劃痕損傷實驗 將進入對數(shù)生長期的細胞懸液放入六孔板中，用200 μl無菌槍頭在每個孔中長滿的單層細胞上劃1～2道痕，在顯微鏡下觀察劃痕修復的過程，分別于0、24、36 h拍照記錄，比較不同細胞損傷修復速度。

1.9 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 以lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染siRNA于24孔細胞培養(yǎng)板，室溫孵育5 min。再用50 μl上述培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)，孵育完畢后將脂質(zhì)體-siRNA混合液加入24孔板內(nèi)。培養(yǎng)6 h后，將24孔板里含有脂質(zhì)體-siRNA混合液的培養(yǎng)基吸棄，48 h觀察細胞功能。

1.10 Transwell實驗 將基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)液按1∶5比例稀釋，吸取200 μl稀釋后的基質(zhì)膠溶液均勻鋪在小室上室面，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。基質(zhì)膠凝固后，向24孔板孔內(nèi)加入500 μl含10% FBS的培養(yǎng)液，F(xiàn)BS作為趨化因子誘導細胞穿膜。將細胞制成單細胞懸液接種至小室內(nèi)，將小室浸入4%的多聚甲醛溶液中固定10 min，結(jié)晶紫溶液染色5 min，顯微鏡下觀察并拍照。

1.11 平板克隆實驗 將細胞制成單細胞懸液，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)10 d，PBS清洗，4%多聚甲醛溶液固定，結(jié)晶紫染色，PBS清洗，拍照后計數(shù)克隆數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 放療對HMGB1表達影響 與正常肺泡上皮細胞BEAS-2B比較，HMGB1在肺癌細胞H-1299中表達顯著上調(diào)(P<0.05，圖1a)。10 Gy放療48、96 h后，HMGB1均較對照組顯著降低(P<0.05，圖1b)。

圖1 放療對HMGB1表達影響(a.HMGB1蛋白在正常肺泡上皮細胞BEAS-2B和肺癌細胞H-1299中的表達；b.放療對HMGB1蛋白表達的影響)

2.2 HMGB1沉默對H-1299細胞增殖的影響 MTT與細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，HMGB1沉默后，隨著放療劑量增加，H-1299細胞活力顯著降低(P<0.05，圖2)。

圖2 HMGB1沉默對H-1299細胞增殖的影響(a.48 h MTT結(jié)果；b.96 h MTT結(jié)果；c～d.細胞克隆形成實驗結(jié)果)

2.3 HMGB1沉默對H-1299細胞遷移及侵襲的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，HMGB1沉默后，放療劑量越大，H-1299細胞遷移所受影響越明顯(P<0.05，圖3a)。Transwell實驗結(jié)果顯示，HMGB1沉默后，隨著放療劑量增加，H-1299細胞侵襲能力顯著降低(P<0.05，圖3b)。

圖3 HMGB1沉默對H-1299細胞遷移及侵襲的影響(a.劃痕實驗結(jié)果；b.Transwell實驗結(jié)果)

2.4 HMGB1沉默對H-1299細胞細胞周期的影響 HMGB1沉默后H-1299細胞G1期減少，G2期增加；給予放療后，細胞周期明顯阻滯，G1期減少及G2期增加程度更明顯。見圖4。

圖4 HMGB1沉默對H-1299細胞細胞周期的影響

2.5 HMGB1沉默對H-1299細胞凋亡的影響 HMGB1沉默后，隨著放療劑量增加，H-1299細胞凋亡率明顯增加(P<0.05，圖5)。

圖5 HMGB1沉默對H-1299細胞細胞周期凋亡的影響

2.6 HMGB1沉默對hTERT相關信號通路的影響 HMGB1沉默導致hTERT、RFPL3、CBP、TRF1和TRF2蛋白表達均有不同程度的降低，而給予放療后，這些蛋白的表達均顯著降低(P<0.05，圖6)。

圖6 HMGB1沉默對hTERT相關信號通路的影響

3 討論

HMGB1過表達與乳腺癌、直腸癌、膀胱癌、鼻咽癌和食管癌密切相關[7-9]。HMGB1在炎癥、血管生成、自噬、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要作用[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在體外照射后，明顯抑制肺癌細胞增殖，提示HMGB1在肺癌生長中起重要作用。DNA損傷需要HMGB1-hTERT的積累，且hTERT受HMGB1釋放刺激調(diào)控[12]。HMGB1通過不同的信號通路促進腫瘤生長，HMGB1/RAGE的激活與基質(zhì)金屬蛋白酶的表達、腫瘤的增殖和遷移有關[13]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，shRNA沉默HMGB1的表達可降低食管癌細胞在照射后的遷移和侵襲能力[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1通過改變端粒結(jié)合蛋白如TPP1(PTOP)、TRF1和TRF2的水平下調(diào)端粒穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)肺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究表明，HMGB1表達降低與端粒損傷和乳腺癌細胞放射敏感性增加有關，提示HMGB1在調(diào)節(jié)端粒和細胞對DNA損傷的反應中起著關鍵作用[15]。另有研究表明，HMGB1表達增加通過啟動MCF-7細胞的G1期阻滯和凋亡抑制細胞生長，提示HMGB1在乳腺癌細胞中具有腫瘤抑制和放射增敏的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1下調(diào)增強了細胞的放射敏感性，降低了端粒長度和hTERT活性，降低的hTERT活性與較高的放射敏感性相關，并可能導致端粒長度的減少。而有研究表明，HMGB1基因沉默后TERT mRNA和蛋白質(zhì)表達無明顯變化[17]。這些結(jié)果之間的差異可能是由于所研究的細胞系不同所致。

細胞周期蛋白D1的主要作用是調(diào)節(jié)細胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，hTERT和細胞周期蛋白D1的積聚可降低腫瘤細胞的放射敏感性，且細胞周期蛋白D1的表達水平與腫瘤細胞的放射抗性呈正相關[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1基因沉默導致細胞周期蛋白D1表達顯著降低，輻射敏感性的增強可能是通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1的表達來實現(xiàn)的。此外，由于細胞周期蛋白D1的減少可以抑制G1/S轉(zhuǎn)變，這解釋了H-1299-shHMGB1細胞的增殖受到顯著抑制的原因，因為M期是細胞周期中對輻射最敏感的階段，這也可能提高了這些細胞的輻射敏感性。

綜上所述，HMGB1下調(diào)破壞人肺癌細胞的端粒穩(wěn)態(tài)，下調(diào)hTERT蛋白表達，增強放射敏感性，HMGB1和hTERT可能是肺癌放射治療療效預測的潛在靶點。