劉翠穎，段天昱，劉俊紅，韓俊茹，李勝強

(1.天津市西青醫(yī)院健康體檢科，天津 300000；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，天津 300000)

在治療細菌性感染的臨床實踐中，具有β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的頭孢菌素是最常用的1種抗生素[1-2]。而頭孢哌酮是第3代廣譜半合成頭孢菌素，對大多數(shù)革蘭陽性厭氧菌、某些類型的革蘭陰性厭氧菌和肺炎球菌都具有良好的治療作用。因此，臨床常常用于治療敏感菌群所導致的呼吸道感染、膽道感染和敗血癥等[3]。

近年來，隨著細菌耐藥性的逐年增加，β-內(nèi)酰胺類抗生素對β-內(nèi)酰胺酶變得越來越敏感。為了應對這種情況，臨床醫(yī)生常常將β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑聯(lián)合使用治療敏感菌群所導致的感染[4]，但合理的使用抗生素需要實時監(jiān)測患者體內(nèi)抗生素的血藥濃度。相關(guān)報道顯示，頭孢哌酮在人體內(nèi)的藥代動力學個體差異非常大，特別是對于那些顱內(nèi)感染的患者，由于人類血腦屏障的天然存在，很大程度阻止了抗菌藥物在腦脊液中的滲透，因此，藥物在患者顱內(nèi)就很難達到有效的抑菌濃度[5]。而對于肝腎功能不全的患者，由于其自身原因使藥物的半衰期延長，造成藥物在體內(nèi)積累，極易引起嚴重的不良反應。因此，臨床上常常需要監(jiān)測這些患者體內(nèi)抗菌藥物的濃度，最大限度地減小藥物毒性并提高藥物療效，從而降低藥物不良反應的發(fā)生率[6]?；谝陨显?，急需發(fā)展一種監(jiān)測人體內(nèi)頭孢哌酮濃度新的方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

MPI-B型多參數(shù)化學發(fā)光分析儀購自西安瑞邁公司；Millipore-Q純水儀購自密理博中國公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲清洗器購自昆山市超聲儀器公司；Thermo高速離心機購自賽默飛世爾公司。

1.2 方法

1.2.1儲備液制備

頭孢哌酮標準儲備液(1.0×10-4g/mL)的制備：稱取0.010 0 g的頭孢哌酮標準品(華工標準物質(zhì))，用適量的去離子水溶解后，定容至100 mL并置于4 ℃冰箱備用。鐵氰化鉀儲備液(2.0×10-3mol/L)的制備：稱取0.065 9 g鐵氰化鉀(上海生工生物工程有限公司)用適量的去離子水溶解后，定容至100 mL并貯于容量瓶備用。魯米諾儲備液(2.0×10-3mol/L)的制備：稱取0.035 4 g魯米諾(上海生工生物工程有限公司)，用適量的0.12 mol/L氫氧化鈉(上海生工生物工程有限公司)溶解后，定容至100 mL，貯于棕色容量瓶中備用，使用時用0.12 mol/L氫氧化鈉溶液逐級稀釋。所有試劑均為分析純級別且未經(jīng)進一步純化，實驗中所使用的水均是18 M的去離子水。

1.2.2實驗方法

試劑和樣品溶液(A～D)通過蠕動泵輸送，通過旋轉(zhuǎn)注射閥(V)將樣品溶液和試劑引入流通檢測池(E)中，充分混合后發(fā)生化學反應并產(chǎn)生發(fā)光信號，由于產(chǎn)生信號微弱，需經(jīng)光電倍增管(PMT)放大后并輸入計算機中進行檢測分析，見圖1。其中，當A流路為純水時產(chǎn)生的信號為空白信號記為I0，當A流路為頭孢哌酮時產(chǎn)生的信號為增強信號記為Ia，那么該體系的相對發(fā)光強度則為Ia-I0，記為ΔI。

A：樣品溶液或空白溶液；B：魯米諾溶液；C：氫氧化鈉溶液；D：鐵氰化鉀溶液；P1和P2：蠕動泵；V：旋轉(zhuǎn)注射閥；E：流通池；W：廢液池；PMT：光電倍增管；HV：負高壓；PC：計算機。

1.2.3儀器參數(shù)

1.2.3.1采樣時間的選擇

由于該體系的反應動力學快，因此，選擇合適的采樣時間就顯得非常重要。本研究評估了5～20 s儀器采樣時間對該體系的相對發(fā)光強度的影響，參考相關(guān)文獻及經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，當采樣時間為5 s時，該反應體系的相對發(fā)光強度就能夠達到最大且信號穩(wěn)定。因此，采樣時間確定為5 s。

1.2.3.2泵速的選擇

泵速過大或過小都可能影響整個方法的分析性能，為了獲得較低的檢測限和較寬的線性范圍，本研究觀察了蠕動泵的速度對該體系的相對發(fā)光強度的影響，參考相關(guān)文獻及經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，當泵速達到30 r/min時，該體系的能夠獲得較高相對發(fā)光強度且信號穩(wěn)定。因此，泵速確定為30 r/min。

1.2.3.3光電倍增管負高壓的選擇

為了獲得該體系相對發(fā)光強度的最佳信噪比，本研究評估了光電倍增管的負高壓在600～800 V的變化對該體系相對發(fā)光強度的影響，參考相關(guān)文獻及經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，當負高壓為650 V時，該體系的信噪比最優(yōu)。因此，光電倍增管負高壓確定為650 V。

無障礙導向主要包括以下內(nèi)容：盲人導向帶（盲導帶）、盲文導向牌（盲導牌）、專用電梯（即殘疾人液壓梯）、樓梯升降機（即樓梯牽引機）及輪椅坡道、專用電梯及樓梯升降機吊頂導向燈箱、殘疾人標識牌等。

1.2.4干擾實驗

藥物中包含的各種無機物化合物、有機化合物及其賦形劑和血漿中的一些物質(zhì)可能對頭孢哌酮測定的存在影響。為了驗證該方法的特異性，在選定的最優(yōu)實驗條件下，以相對標準偏差小于5%的允許量，檢測樣品中的常見物質(zhì)對血漿頭孢哌酮測定的可能影響。

1.2.5樣品分析

為了進一步評價該方法的可靠性和實際樣品的檢測能力。取健康志愿者血漿，用適量去離子水稀釋并加入頭孢哌酮，待用。檢測時，用去離子水稀釋至該方法的線性范圍內(nèi)，用建立的流動注射化學發(fā)光法測定后，計算出血漿中頭孢哌酮的含量，最后對測定樣品行加標回收實驗。

2 結(jié) 果

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1反應物混合順序的選擇

該反應體系中許多試驗條件都影響著相對化學發(fā)光強度，其中反應物混合順序?qū)ο鄬瘜W發(fā)光強度的影響比較明顯。研究表明，(頭孢哌酮+魯米諾)+(氫氧化鈉+鐵氰化鉀)相對化學發(fā)光強度比另兩種(頭孢哌酮+氫氧化鈉)+(魯米諾+鐵氰化鉀)和(頭孢哌酮+鐵氰化鉀)+(氫氧化鈉+魯米諾)相對化學發(fā)光強度大且穩(wěn)定。因此，選擇(頭孢哌酮+魯米諾)+(氫氧化鈉+鐵氰化鉀)作為后續(xù)試驗的混合順序。

2.1.2魯米諾濃度的選擇

圖2 魯米諾濃度

2.1.3鐵氰化鉀濃度的選擇

該體系中的氧化劑是鐵氰化鉀，很明顯其濃度變化對相對化學發(fā)光強度有影響。因此，本研究評估了濃度在8×10-6～30×10-6mol/L的鐵氰化鉀溶液對相對發(fā)光強度產(chǎn)生的影響。結(jié)果如圖3所示，隨著鐵氰化鉀濃度的增加，該體系的相對發(fā)光強度持續(xù)增強，但當鐵氰化鉀濃度超過25×10-6mol/L后，該體系的相對發(fā)光強度反而逐漸減弱且穩(wěn)定性變差，見圖3。

圖3 鐵氰化鉀濃度

2.1.4堿性介質(zhì)的選擇

堿性介質(zhì)對該反應體系的相對發(fā)光強度也有明顯的影響，氫氧化鈉比碳酸鈉和碳酸氫鈉對鐵氰化鉀與魯米諾體系的發(fā)光強度增敏作用大且信號穩(wěn)定，故選用氫氧化鈉作為本研究的堿性介質(zhì)。本研究分析了氫氧化鈉在30×10-3～140×10-3mol/L變化對該體系相對化學發(fā)光強度的影響。研究表明，當氫氧化鈉濃度為120×10-3mol/L時，該體系的相對發(fā)光強度最大且穩(wěn)定，見圖4。

圖4 氫氧化鈉濃度

2.2 標準曲線、檢出限及精密度

通過對影響實驗的主要條件(包括魯米諾的濃度、鐵氰化鉀的濃度及堿性介質(zhì)的選擇及其濃度的確定等)優(yōu)化，確定了最優(yōu)的實驗條件。在此條件下，采用流動注射化學發(fā)光法檢測血漿中頭孢哌酮的濃度，見圖5。該體系相對發(fā)光強度與頭孢哌酮在0.2×10-5～5.2×10-5g/mL呈良好線性關(guān)系，該反應的線性方程是ΔI=2 672.60+2.76×108 C，相關(guān)系數(shù)為0.986 0，根據(jù)IUPAC建議，以3倍空白標準偏差計算該方法的檢出限為7.1×10-7g/mL，該方法精密度的確認是采用多次平行測定不同濃度的頭孢哌酮方法(濃度為3.0×10-5g/mL，4.0×10-5g/mL，n=11)，測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)分別為2.49%和0.51%。因此，該體系所建立的分析方法有良好的重復性。

圖5 頭孢哌酮的校正曲線

2.3 干擾實驗結(jié)果

300倍的K+、Na+、NH4+、SO42-、NO3-、PO43-，60倍的復合維生素、復合氨基酸、淀粉、葡萄糖和糊精均不影響血漿中頭孢哌酮測定。因此，該方法具有良好的特異性。

2.4 樣品分析結(jié)果

該方法對血漿中頭孢哌酮回收率在100.5%～101.0%，RSD為1.10%～6.11%,見表1。

3 討 論

本課題組成功構(gòu)建了一種檢測血漿中頭孢哌酮的流動注射化學發(fā)光的新方法。本研究中優(yōu)選了反應物的混合順序，通過對各反應物濃度的逐項研究，確定了在本研究中當魯米諾為9×10-6mol/L、鐵氰化鉀為25×10-6mol/L、氫氧化鈉為120×10-3mol/L時，該體系的相對化學發(fā)光強度最大且穩(wěn)定。同時還優(yōu)化了實驗儀器的關(guān)鍵參數(shù)，優(yōu)選出了5 s的采樣時間，30 r/min的泵速及650 V的負高壓。在此實驗條件下，該反應體系的相對化學發(fā)光強度與0.2×10-5～5.2×10-5g/mL的頭孢哌酮呈良好的線性關(guān)系。檢出限為7.1×10-7g/mL，該方法的靈敏度高、選擇性強、精密度優(yōu)，并成功地運用于人血漿中頭孢哌酮含量測定。

據(jù)報道，目前檢測頭孢哌酮大多采用高效液相色譜法[7-9]、芯片電泳[4]、紫外分光光度法[10]、二維高效液相色譜法[3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]等。毫無疑問，以上這些方法可以準確地監(jiān)測患者體內(nèi)頭孢哌酮的濃度，但是仍然存在一些明顯缺點，如高效液相色譜法/二維高效液相色譜法不僅需要高純度的有機溶劑和復雜的前期樣品準備，且方法穩(wěn)定時間較長；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法除需要昂貴的實驗儀器外，還需要專門人才進行操作。因此，建立一種簡便、靈敏、低成本的檢測頭孢哌酮的新方法十分必要。

一般來說，化學發(fā)光是在放熱化學反應過程中產(chǎn)生的電磁輻射[14]。近年來，流動注射化學發(fā)光法作為一種定量分析方法，因其具有寬泛的線性范圍、較高的靈敏度及較快的響應速度等優(yōu)點，在環(huán)境檢測、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品分析等領(lǐng)域得到了廣泛應用[15-17]。迄今為止，以魯米諾體系為基礎(chǔ)的頭孢哌酮流動注射分析方法還少見報道。因此，本課題組建立了以魯米諾體系為基礎(chǔ)的流動注射化學發(fā)光法分析血漿中頭孢哌酮的濃度。

綜上所述，本文基于頭孢哌酮對魯米諾與鐵氰化鉀化學發(fā)光體系的增敏作用，首次建立了一種流動注射化學發(fā)光法測定血漿中頭孢哌酮。相對于彭國茳等[3]報道的傳統(tǒng)的色譜分析法，該方法不僅克服了包括儀器昂貴、預處理工藝復雜、操作專業(yè)等明顯缺點，且實現(xiàn)了操作簡單、5 s內(nèi)快速完成采樣、低成本的檢測人血漿中的頭孢哌酮的濃度。為了使該方法達到最優(yōu)性能，本課題組對可能影響該方法的實驗因素進行了優(yōu)化，最終確定了適合該方法的最佳魯米諾和鐵氰化鉀的濃度及最佳堿性介質(zhì)及其濃度等，在此實驗條件下，本研究建立了檢測頭孢哌酮的標準曲線，該曲線展示出了較寬的線性范圍(達1個數(shù)量級)，較高的靈敏度(檢出限達7.1×10-7g/mL)及較快的分析速度。該方法不僅可滿足該藥的臨床治療濃度監(jiān)測，且為其他抗生素的血藥濃度監(jiān)測和快速分析檢測提供了一種新思路。更進一步講，這種基于鐵氰化鉀與魯米諾化學發(fā)光體系所建立流動注射化學發(fā)光法為生物醫(yī)學研究、臨床化學、新藥研發(fā)及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的廣泛應用奠定了堅實的基礎(chǔ)。