韓 君 李厚聰 張志鋒 王曉彤 陳敬然 張志強(qiáng)

1.北京康仁堂藥業(yè)有限公司/北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京 101301；2.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000；3.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041

厚樸藥材規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)中，按來源將厚樸劃分為溫樸和川樸2種，按取皮部位再劃分為4種規(guī)格筒樸、蔸樸、根樸、枝樸，每一種規(guī)格又按長度和質(zhì)量劃分一等、二等、三等、四等若干等級[1-2]。厚樸規(guī)格等級劃分主要是以性狀特征、特征圖譜、揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性化學(xué)成分差異為依據(jù)[3]，然而特征圖譜需要大量標(biāo)準(zhǔn)品以及現(xiàn)有研究缺少對厚樸相關(guān)化合物的多級質(zhì)譜裂解途徑及其規(guī)律的研究，操作性不強(qiáng)，揮發(fā)性成分由于其成分復(fù)雜, 其中性質(zhì)相似的組分保留時(shí)間較為接近, 色譜峰重疊嚴(yán)重, 較難準(zhǔn)確定性和定量[4]；依據(jù)性狀特征劃分商品規(guī)格等級，這種方法是否有科學(xué)內(nèi)涵又值得商榷[5]。

核磁共振技術(shù)(NMR)具有良好的分析復(fù)雜成分的能力，近年來廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)和復(fù)雜成分分析，并取得了良好的效果[6-8]，其中有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道采用一維NMR光譜對厚樸進(jìn)行相關(guān)研究[9]，但一維NMR方法譜峰分離不佳譜圖上識(shí)別不了更多的化學(xué)基團(tuán)，二維NMR譜除了包含一維NMR譜中的信息，還含有更多的結(jié)構(gòu)信息[10]。本研究應(yīng)用核磁共振技術(shù)1HNMR、13CNMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC對四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉進(jìn)行化學(xué)成分分析，彌補(bǔ)了化學(xué)分析中特征圖譜需要大量標(biāo)準(zhǔn)品以及現(xiàn)有研究缺少對厚樸相關(guān)化合物的多級質(zhì)譜的裂解途徑及其規(guī)律的研究。臨床中厚樸入藥的形式多為水煎煮湯劑，故本研究對水提物化學(xué)成分進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與軟件 Bruker AVANCEII500MHz超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)，5 mm核磁管(美國Norell公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；BSA124S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；Spectrum Two FI-IR Spectrometer(PerkinEImer公司)；NMR譜圖通過Bruker Topspin 4.0.8及MestReNova 9.0.1軟件處理。

1.2 材料與試劑 收集四川省共8份厚樸樣本，由西南民族大學(xué)張志鋒教授鑒定為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.，詳細(xì)信息見表1；氘代二甲基亞砜 (DMSO-d6)購自美國CIL公司。

表1 四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮樣品信息以及厚樸酚與和厚樸酚的HPLC含量測定

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 稱取厚樸樣品60 g置于圓底燒瓶中加水1000 mL，加熱回流1 h，提取液于65 ℃減壓濃縮，濃縮液冷凍干燥，取固體粉末10 mg至NMR樣品管中，加入氘代二甲基亞砜0.6 mL溶解，3500 r/min離心5 min，移液槍取上清液轉(zhuǎn)移至NMR樣品管中用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 NMR實(shí)驗(yàn)條件1H和13C-NMR的工作頻率分別為500.13和125.95 MHz，實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃，譜寬分別為12376.24和35971.22 Hz。1H-1H COSY和1H-13C HSQC實(shí)驗(yàn)分別采用COSYGPMFQF和HSQCEDETGPSI標(biāo)準(zhǔn)脈沖程序。1H-1H COSY的F2維(1H)和F1維(1H)譜寬均為5000Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=2048×256，累加次數(shù)為16；HSQC的F2維(1H)和F1維(13C)譜寬分別為5000 Hz和25155 Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=1024×256，累加次數(shù)為16[11]。NMR譜圖通過Bruker Topspin 4.0.8及MestReNova 9.0.1軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 厚樸根皮水提凍干粉的UV與IR分析 厚樸根皮水提物的紫外吸收光譜的譜圖上(圖1)可以清晰見到兩個(gè)吸收帶，205 nm為強(qiáng)吸收帶(K帶)，是分子中共軛烯烴的吸收帶，屬于π→π*躍遷。284 nm為弱吸收帶(R帶)，是分子中羰基的吸收帶，屬于n→π*躍遷。紅外吸收光譜在波數(shù)3381、1075 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羥基；在波數(shù)2932、1413 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有亞甲基和甲基；在波數(shù)1608 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羰基基團(tuán)；在波數(shù)1506、914 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有烯烴；在波數(shù)1270、1230 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有醚鍵；在波數(shù)820 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有苯環(huán)；3150～3260 cm-1區(qū)間應(yīng)該還有一個(gè)vC=C-H烯烴碳?xì)涞纳炜s振動(dòng)；在990 cm-1附近未出現(xiàn)一個(gè)明顯的端烯的特征峰，從該譜圖推知(圖2)，含有magnoloside B類似物的特征峰，同樣也含有厚樸酚類似物的羥基、烯烴、亞甲基、苯環(huán)等特征峰。

2.2 厚樸根皮水提凍干粉的NMR分析 根皮水提凍干粉的核磁測試溶劑：氘代DMSO-d6。它的核磁共振氫譜(圖3)信號盡管比較復(fù)雜，但依然可辨相對主要的信號。它的氫譜在芳香區(qū)域顯示一組典型的1,2,4-三取代苯環(huán)信號：6.93 (2H, m)、6.79 (1H, d,J=8.8 Hz)，在烯烴信號區(qū)域檢測到一組乙烯基：5.93 (1H, m)、5.06 (1H,br d,J=17.0 Hz)、5.00 (1H, br d,J=10.0 Hz)，此外在高場區(qū)檢測到一個(gè)積分值為兩個(gè)氫的寬雙峰信號：3.27 (2H, br d,J=6.7 Hz)。它的碳譜(圖4)也檢測到一系列信號，借助二維核磁HSQC信號(圖5)，可辨識(shí)高場區(qū)一個(gè)亞甲基碳信號：38.7；源于乙烯基的兩個(gè)碳：115.1、138.2；苯環(huán)上的三個(gè)次甲基碳：115.9、127.8、131.1。在二維核磁1H,1H-COSY譜中(圖6)，觀察到高場處的那個(gè)亞甲基雙峰信號與乙烯基氫信號均有相關(guān)，以及苯環(huán)上由于3J耦合而產(chǎn)生的相關(guān)信號?；谏鲜鲆痪S、二維核磁圖譜的仔細(xì)分析，可得出該結(jié)構(gòu)中含有苯丙素結(jié)構(gòu)單元，考慮到厚樸已報(bào)道化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提示該結(jié)構(gòu)存在對稱因素——即完全對稱的苯丙素二聚體，調(diào)研相關(guān)文獻(xiàn)中的核磁數(shù)據(jù)，最終確定上述核磁信號與厚樸酚結(jié)構(gòu)(1)(圖7)是吻合的。

此外，在氫譜中還檢測到一組微量的、但是可以辨識(shí)的反式烯氫信號：6.30 (1H, d,J=15.8 Hz)、7.47 (1H, d,J=15.8 Hz)，提示很可能來源于肉桂?；?；在高場區(qū)可見雙峰甲基信號：1.12 (3H, d,J=6.0 Hz)，借助HSQC譜可知該甲基的碳信號位于17.8 ppm，在1H,1H-COSY譜觀察到該甲基雙峰與3.77的連氧氫信號有耦合，提示微量成分中很可能含有鼠李糖片段。在氫譜的3.0～4.0 ppm、碳譜的60～85 ppm區(qū)間可見若干來源于糖上的信號，氫碳譜的芳香區(qū)也有若干信號，考慮到厚樸已報(bào)道化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，調(diào)研相關(guān)文獻(xiàn)中的核磁數(shù)據(jù)，推測根皮水提凍干粉中還含有微量的苯乙醇苷類成分，如magnoloside A、magnoloside B。但由于在提取物中的占比相對微量，尚不能做到準(zhǔn)確的定性。

四川產(chǎn)厚樸根皮水提凍干粉的主要成分是厚樸酚，微量成分為苯乙醇苷類。

2.3 厚樸干皮水提凍干粉的UV與IR分析 厚樸干皮水提取的紫外吸收光譜的譜圖上(圖1)可以清晰見到三個(gè)吸收帶，204 nm為強(qiáng)吸收帶(K帶)，是分子中共軛烯烴的吸收帶，屬于π→π*躍遷。284 nm為弱吸收帶(R帶)，是分子中羰基的吸收帶，屬于n→π*躍遷。322 nm為弱吸收帶(R帶)，是分子中共軛羰基的吸收帶，共軛結(jié)構(gòu)使能量下降，吸收光發(fā)生了紅移，屬于n→π*躍遷。紅外吸收光譜在波數(shù)3393、1074 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羥基；在波數(shù)2934、1418 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有亞甲基和甲基；在波數(shù)1607 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羰基基團(tuán)；在波數(shù)1516 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有烯烴；在波數(shù)1269 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有醚鍵；在波數(shù)814 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有苯環(huán)。該紅外譜圖中同樣能在3150～3260 cm-1區(qū)間觀察到一個(gè)被掩蓋掉的強(qiáng)吸收峰，在990 cm-1附近細(xì)看可隱約觀察到一個(gè)待出的的端烯峰，從該譜圖(圖2)推知，含有magnoloside B類似物的特征峰，同樣也含有厚樸酚類似物的羥基，烯烴，亞甲基，苯環(huán)等特征峰以及隱約的端烯峰，因此該譜圖應(yīng)含有magnoloside B及厚樸酚類似物。

2.4 厚樸干皮水提凍干粉的NMR分析 干皮水提凍干粉的核磁測試溶劑：氘代DMSO-d6。在氫譜(圖3)中檢測到一組特征性的反式烯氫信號：6.30 (1H, d,J=15.8 Hz)、7.47 (1H, d,J=15.8 Hz)，在6.55～7.15 ppm區(qū)間可見多組苯環(huán)的1,2,4-三取代芳?xì)湫盘?，?.6～4.0 ppm未見芳甲醚信號，可推斷上述信號來源于咖啡?；?；在高場區(qū)檢測到雙峰甲基信號：1.12 (3H, d,J=6.0 Hz)，借助HSQC譜(圖5)確定該甲基的碳信號位于17.7 ppm，在1H,1H-COSY譜(圖6)觀察到該甲基雙峰與3.78的連氧氫信號有耦合，提示了鼠李糖片段的存在。在氫譜的2.63 ppm處檢測到連苯環(huán)的亞甲基信號，通過HSQC譜確定該亞甲基的碳信號位于35.1 ppm，在1H,1H-COSY譜中觀察到該亞甲基氫與3.52/3.80處有相關(guān)，可初步推斷為苯乙醇苷類。在氫譜的5.53 ppm處檢測到一個(gè)耦合常數(shù)為2.9 Hz的三重峰，這是吡喃阿洛糖C-3位氫的診斷性信號，大幅度低場位移提示了阿洛糖的C-3位羥基與咖啡酸成酯。此外，在4.0～5.0 ppm區(qū)間可見多個(gè)阿洛糖端基氫、葡萄糖端基氫以及鼠李糖端基氫信號，前兩者為耦合接近8 Hz的雙峰，后者呈現(xiàn)寬單峰，在氫譜的3.0～4.0 ppm、碳譜的60～85 ppm區(qū)間可見若干來源于糖上的信號?？紤]到厚樸已報(bào)道化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，調(diào)研相關(guān)文獻(xiàn)中的核磁數(shù)據(jù)，可確定干皮水提凍干粉中富含苯乙醇苷類成分，如magnoloside A、magnoloside B或它們的結(jié)構(gòu)類似物。由于該類成分的核磁信號異常復(fù)雜，又是多個(gè)類似結(jié)構(gòu)的混合物，未能確定具體的苯乙醇苷類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

此外，它的核磁共振氫譜中在烯烴信號區(qū)域依稀可辨一組乙烯基：5.93 (1H, m)、5.06 (1H, br d,J=17.0 Hz)、5.00 (1H, br d,J=10.0 Hz)，這是厚樸酚的特征性信號。盡管信號非常微弱，但對它的結(jié)構(gòu)定性是可靠的。

四川產(chǎn)厚樸干皮水提凍干粉富含苯乙醇苷類成分，此外依稀可見微量的厚樸酚。

2.5 四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉NMR變量數(shù)據(jù)差異性檢驗(yàn) 選擇SPSS軟件對四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉NMR變量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用平方歐式距離作為厚樸根皮和干皮間距離的計(jì)算方式。

由表2可知，P值為0.987，大于0.05，故根皮組內(nèi)的的數(shù)據(jù)沒有差異性。

由表3可知，P值為0.976，大于0.05，故干皮組內(nèi)的的數(shù)據(jù)沒有差異性。

表2 厚樸根皮NMR差異性檢驗(yàn)結(jié)果

表3 厚樸干皮NMR差異性檢驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，在萊文方差等同性檢驗(yàn)中，P值為0.134，大于0.05，所以選擇等方差的數(shù)據(jù)。在平均值等同性t檢驗(yàn)中，P值為0.012，小于0.05，所以可以認(rèn)為根皮和干皮組之間存在差異。四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉聚類分析結(jié)果如圖8所示。

表4 厚樸根皮和干皮兩種規(guī)格NMR差異性檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 討論 常規(guī)1H-NMR中水峰信號很強(qiáng)，溶劑信號雖然弱些，但相對于除水峰以外的其它信號仍然很大。上述信號不僅直接影響了對所處區(qū)域其它信號的觀測，更主要是由于水峰和溶劑信號構(gòu)成了核磁共振中自由衰減信號的主體，必然會(huì)抑制低濃度組分信號的信噪比改善[12]。

預(yù)飽和方法是所有壓制水峰的方法中最方便，效果也最好的方法。針對樣品的自身特殊性和實(shí)驗(yàn)的目的要求，確定了以雙溶劑預(yù)飽和脈沖序列為獲取1H-NMR圖譜的技術(shù)手段，該脈沖序列具有對多組信號進(jìn)行選擇性壓制功能[12]如圖9所示。脈沖序列：RD-90°-t1-90°-tm-90°-FID參數(shù)：t1為2.4s、混合時(shí)間tm為100 ms、譜寬10000 Hz、累加次數(shù)為32。

3.2 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)對四川產(chǎn)厚樸根皮與干皮水提凍干粉進(jìn)行紅外吸收光譜(IR)、紫外吸收光譜(UV)及核磁共振(NMR)波譜(包括1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC)進(jìn)行了測定，分析了其UV和IR譜圖特征吸收峰對應(yīng)的基團(tuán)，并對其1H NMR和13C NMR信號進(jìn)行了歸屬，上述波譜學(xué)數(shù)據(jù)說明了四川產(chǎn)厚樸根皮水提凍干粉的主要成分是厚樸酚，微量成分為苯乙醇苷類，厚樸干皮水提凍干粉富含苯乙醇苷類成分，此外依稀可見微量的厚樸酚，其中水溶性成分苯乙醇苷被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于厚樸之中，并由于其突出的生物活性而引起了更多的關(guān)注，比如止痙攣的作用、酶抑制效果、抗氧化性[13]。值得注意的是，在早期研究中，苯乙醇苷和厚樸苷A均在胃腸功能障礙動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出明顯的療效[14]，這意味著苯乙醇苷可能有助于厚樸藥材發(fā)揮臨床效果。因此，明確了厚樸干皮與根皮生物活性成分差異，為合理選擇厚樸不同藥用部位作為原材料開發(fā)不同功效的藥物提供參考。同時(shí)該研究為建立中藥厚樸不同規(guī)格核磁共振化學(xué)信息提供參考資料，亦為中藥厚樸規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)制定提供基礎(chǔ)資料。