溫榮城 賈金艷 李 霞 柴 立 陳 真

1. 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2. 貴州宏宇藥業(yè)有限公司，貴州 貴陽 550018；3.昆明醫(yī)科大學(xué)科技成果孵化中心，云南 昆明 650500

我國自古有采用熏蒸藥材或佩戴含藥材的香囊來避疫、防病的傳統(tǒng)，稱之為“芳香避穢”。芳香類藥材具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)的作用[1- 2]。金喉健噴霧劑(國藥準字Z20025361)是基于民族藥用植物艾納香[Blumeabalsamifera(L.)DC.]和大果木姜子(LitsealancilimbaMerr.)兩個芳香類藥材的現(xiàn)代中成藥制劑，其中含有大量揮發(fā)油、黃酮和萜類成分[3-6]，在臨床上被廣泛用于急慢性咽炎、扁桃體炎、急性支氣管炎、小兒皰疹性咽峽炎等多種疾病[7-10]，也有被用于治療柯薩奇病毒感染引發(fā)的手足口病，緩解口腔局部癥狀的相關(guān)報道[11-13]。金喉健噴霧劑顯現(xiàn)出具有抗病毒活性的新應(yīng)用潛質(zhì)，但迄今未有直接的研究報道。

本研究采用現(xiàn)代CO2超臨界提取工藝獲得金喉健傳統(tǒng)配方中的提取物，通過H1N1流感病毒感染MDCK細胞來評價該提取物的體外抗病毒作用，符合中藥品種二次開發(fā)和民族醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新與發(fā)展戰(zhàn)略，為拓展金喉健噴霧劑在防治呼吸道傳播疾病方面的新應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；DMSO(天津津東天正精細化工試劑廠)；奧司他韋(OSV，安耐吉公司)；TPCK-胰蛋白酶(上海國源生物技術(shù)有限公司)；CellTiter-Glo試劑盒((Promega Corp., Madison, WI, USA)。

1.2 儀器 QP-160型CO2恒溫培養(yǎng)箱(BIOBASE公司)；XDS-1倒置相差顯微鏡(深圳市星明光學(xué)儀器有限公司)；L500低速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司)；1510全波長酶標(biāo)儀(Thermofisher公司)。

1.3 病毒與細胞 甲型流感病毒減毒株A/WSN/33(H1N1)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所提供；犬腎細胞(Madin-Daby canine kidney cells, MDCK)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所提供。

2 方法

2.1 供試品制備 使用超臨界CO2提取法對金喉健配方的中藥飲片進行提取獲得提取物，由貴州宏宇藥業(yè)有限公司提供(批號：19ZY023001)。以DMSO溶解提取物配置成濃度為10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.63 mg/mL、0.32mg/mL、0.16 mg/mL、0.08 mg/mL的母液，再分別將母液用培養(yǎng)基稀釋，依次配置成為100 μg/mL 、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.13 μg/mL、1.56 μg/mL和0.78 μg/mL八個濃度，作為提取物組待測溶液。

以DMSO溶解OSV，再用培養(yǎng)基稀釋為100 μm/mL濃度，作為陽性對照組待測溶液；配置含1%DMSO的培養(yǎng)基，作為空白對照組待測溶液。

2.2 病毒培養(yǎng)與毒力測定 將病毒接種于9～11日齡的雞胚尿囊腔，35 ℃培育72 h，無菌操作收獲尿囊液。3000 rpm離心15 min以除去沉淀，收集上清液。將收集的病毒液做10倍系列稀釋為10-1至10-8共8個稀釋度，加入已貼壁的96孔板MDCK細胞中，每個濃度8個孔，每孔細胞大約3×104個，同時設(shè)空白對照組。各孔中MDCK細胞于35℃吸附病毒2 h后換用培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(37℃，5%CO2)，48 h后在顯微鏡下觀察細胞病變效應(yīng)，根據(jù)按Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量TCID50/mL=10-6.25。

2.3 提取物對細胞的毒性作用測定 將MDCK細胞以每孔3×104個細胞接種于96孔板，置培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中，待細胞單層吸附于96孔板，吸棄上清液。分別加入100μL不同濃度提取物溶液作為提取物組，每個濃度重復(fù)3個孔，同時設(shè)陽性對照組(OSV， 100 μM/mL)和空白對照組(DMSO，1%)，置培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中培養(yǎng)36～40 h后，采用CellTiter-Glo試劑盒檢測細胞活力。

細胞活力=各組細胞的檢測值/空白對照組細胞的檢測值×100%

2.4 提取物對流感病毒感染細胞活性的影響 取細胞已單層吸附的96孔板，接種100 TCID50病毒液，每孔100 μL，在培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中吸附2 h后，吸棄病毒液。往各孔中分別加入不同濃度提取物溶液作為提取物組，每個濃度重復(fù)3個孔，同時設(shè)陽性藥組、病毒對照組和空白對照組。置培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中培養(yǎng)36～40 h以后，測定含病毒狀態(tài)下各組的細胞活力。計算提取物對病毒的抑制率，采用Probit回歸分析[14]得出半數(shù)抑制濃度(50% Inhibiting Concentration, IC50)，并計算選擇指數(shù)(Selection Index，SI)。

提取物對病毒抑制率=1-(提取物對細胞作用檢測值-提取物對病毒作用檢測值)/(空白組檢測值-病毒對照檢測值)

SI=TC50/IC50

3 結(jié)果

3.1 提取物對細胞毒性作用測定結(jié)果 當(dāng)提取物濃度為0.78 μg/mL、1.56 μg/mL、3.13 μg/mL、6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL和50 μg/mL時，細胞活力與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在取物濃度升高到100 μg/mL時，細胞活力降低至87.42%，低于空白對照組(P<0.05)，提取物在此濃度下表現(xiàn)出輕微細胞毒性，但也可推斷提取物對細胞的半數(shù)中毒濃度(TC50)應(yīng)大于100 μg/mL。見表1。

3.2 提取物體外抗病毒作用測定結(jié)果 當(dāng)提取物濃度為0.78 μg/mL、1.56 μg/mL、3.13 μg/mL時，提取物組的細胞活力與病毒對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明提取物在這些濃度時對流感病毒沒有抑制作用；當(dāng)提取物濃度為6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL時，提取物組細胞活力高于病毒對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明提取物在這些濃度時對流感病毒有抑制作用。見表2。

表1 不同濃度提取物對MDCK細胞活力的影響

表2 不同濃度提取物對病毒抑制作用的影響

3.3 提取物對病毒的半數(shù)抑制濃度 通過Probit回歸分析計算提取物對病毒的半數(shù)抑制濃度(IC50)為8.71 μg/mL，SI = TC50/ IC50，因TC50應(yīng)大于100 μg/mL，所以提取物選擇指數(shù)SI應(yīng)大于11.48。(在此篩選體系下OSV的IC50為7.12 μg/mL)。如圖1所示。

4 討論

流感是由流感病毒引起的一種急性、傳染性呼吸系統(tǒng)疾病，主要通過接觸傳播、飛沫傳播和氣溶膠傳播[15]。人類感染流感病毒后常出現(xiàn)發(fā)燒、肌痛、全身乏力、咳嗽咽痛和鼻炎[16]。2019年流行病學(xué)研究顯示，全球每年有38.9萬例呼吸性死亡與流感有關(guān)，相當(dāng)于全年呼吸性死亡總數(shù)的2%[17]，僅2017年流感引發(fā)的呼吸道感染導(dǎo)致全球945萬人入院和14.5萬人死亡[18]。因此控制流感的流行已是全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)所面臨的重要問題之一。

目前，抗流感病毒的化學(xué)藥主要分為M2離子通道抑制劑、神經(jīng)氨酸酶抑制劑及RNA聚合酶抑制劑三類，其共同特點是針對病毒生命周期中的特異性靶點設(shè)計，作用機理較為清晰，但由于流感病毒基因復(fù)制過程中的高突變率易導(dǎo)致各類抗流感藥物臨床應(yīng)用均受日益顯著的耐藥性限制。M2離子通道抑制劑(M2 Inhibitor),如金剛烷胺，能阻礙病毒外膜與內(nèi)涵體膜融合，達到阻止病毒基因組復(fù)合體無法進入胞漿的目的[19]，但目前流行的流感毒株對金剛烷胺類大多耐藥，金剛烷胺在美國已不被推薦用作抗流感藥物[20]。神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NA Inhibitor)，如奧司他韋，通過抑制流感病毒的NA蛋白發(fā)揮抗病毒作用[21]，如今也已出現(xiàn)耐藥性病毒株的傳播。流感RNA聚合酶抑制劑(RNA Polymerase Inhibitor)，如巴洛沙韋，可阻止聚合酶功能和流感病毒mRNA復(fù)制[22]，此類新藥目前僅在美國和日本上市，尚處于專利保護期[23]，價格昂貴。因此，尋找兼具低耐藥性與經(jīng)濟性優(yōu)勢的新一代病毒抑制劑的研究需求依舊迫切。

天然藥物在我國資源分布廣泛，易獲取，成本低廉，不受化學(xué)藥專利保護制約，是我國創(chuàng)新藥物研究的制高點。民間使用藥用植物在預(yù)防和治療呼吸傳播疾病有著悠久的歷史，在流感防治方面具有獨特的優(yōu)勢，不僅表現(xiàn)出廣譜抗病原微生物作用，同時還兼有提升機體免疫和抗炎功效，從而起到綜合治療的效果[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，金喉健噴配方使用CO2超臨界提取工藝得到的提取物對流感病毒(H1N1)有較好的體外抑制作用，提取物在6.25～50 μg/mL的有效劑量范圍內(nèi)，未見提取物對細胞產(chǎn)生毒性，并且提取物對病毒的半數(shù)抑制濃度(IC50)為8.71 μg/mL，SI大于11.48，證明了該提取物在抗流感病毒方面的有效性和安全性。本研究為未來金喉健噴霧劑的二次開發(fā)，拓展新應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。