葛 亮，曹慧玲，張 潔，徐 敏，朱小飛，陳云峰

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南京 210029

當(dāng)前，缺血性腦卒中占腦血管病的80%左右，主要因為腦血管局部動脈粥樣硬化、血栓脫落及血管損傷等導(dǎo)致腦供血動脈栓塞，從而引起相應(yīng)腦組織缺血、壞死，臨床上通過溶栓、使用抗凝藥物等改善腦血液循環(huán)，但由于其存在出血的風(fēng)險和治療時間窗的狹窄性，使得絕大多數(shù)患者無法得到有效救治，且血管再通導(dǎo)致腦組織缺血再灌注，并通過誘發(fā)氧自由基連鎖反應(yīng)進(jìn)一步加重腦組織損傷[1]。川芎嗪是從中藥傘形科植物川芎的根莖中提取的一種生物堿，有效成分為2,3,5,6-四甲基吡嗪，具有活血、化瘀、理氣的功能，以及擴張血管、改善微循環(huán)、抗氧化、拮抗鈣離子及抗纖維化等作用，廣泛應(yīng)用于腦缺血疾病的治療[2]。本研究探討川芎嗪通過改善腦組織氧化應(yīng)激損傷、提高鈣離子腺苷三磷酸酶(Ca2+-ATP酶)活性及抑制炎癥因子等作用治療腦缺血再灌注損傷，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠，雄性，250～300 g，由上海捷思杰實驗動物有限公司提供，川芎嗪由美國Sigma公司提供。

1.2儀器與試劑 美國ABI公司提供熒光定量PCR儀；美國MD Spectramac M3公司提供多功能酶標(biāo)儀。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液，批號為C428BA0042，由上海生工生物工程有限公司提供；一氧化氮(NO)、超微量Ca2+-ATP酶、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，型號分別為A012-3、A070-4、A003-1、A001-3；cDNA合成試劑盒和One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ均由日本TaKaRa提供。

1.3方法

1.3.1實驗動物分組 實驗動物共分為3組，每組10只。假手術(shù)組：插入線栓但不阻塞大腦中動脈；模型組：線栓法造模，給予磷酸鹽緩沖液(PBS)；川芎嗪組：線栓法造模，造模24 h后，腹腔注射川芎嗪，劑量50 mg/kg，每天注射1次，連續(xù)6 d。

1.3.2線栓法建立腦缺血再灌注模型 采用線栓法致大腦中動脈栓塞(MCAO)建立腦缺血再灌注模型。動物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉，分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，在CCA遠(yuǎn)心端和近心端及ECA處用動脈夾夾閉，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4 mm處剪一小口，將栓線插入到ICA，這時用CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線輕輕系牢栓線。從血管分叉處開始算，當(dāng)插入深度在18 mm時，緊緊系牢CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線，動作輕柔，不要使ICA有任何的牽拉，否則會使栓線脫出CCA。血管外栓線不要留得過長，更不要縫在皮外，大鼠會自行拔出?？p合傷口，單籠飼養(yǎng)觀察。缺血后2 h小心抽出栓線，形成再灌注模型，并于造模第7天處死大鼠，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.3神經(jīng)功能評分 分別于造模第1、3、7 天對各組大鼠進(jìn)行改良神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重程度評分(mNSS)，各項神經(jīng)功能實驗分值之和作為該組大鼠mNSS行為學(xué)評分，分值越高，損傷越嚴(yán)重[3]。

1.3.4TTC染色 用0.2 mmoL PBS配制成2%TTC溶液，避光保存，大鼠麻醉后，快速取腦，將腦組織在0 ℃的生理鹽水中冰凍5 min后，由腦前極與視交叉連線中點向后沿冠狀面每隔2 mm切片，切成5片，切片置于2%TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min，不時翻動腦組織切片，使其均勻接觸到染液。

1.3.5大鼠腦梗死率計算 應(yīng)用image proplus軟件對梗死灶腦組織區(qū)域的光密度進(jìn)行分析，記錄光密度值并計算梗死率。

1.3.6各項指標(biāo)檢測 Ca2+-ATP酶活性、NO、MDA及SOD水平測定采用化學(xué)比色法測定，腦組織炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6及IL-10] 采用PCR法測定，具體操作方法參照試劑盒說明書。炎癥因子基因相對表達(dá)水平采用mRNA 2-ΔΔCT表示。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能評分比較 各組大鼠造模前mNSS行為學(xué)評分均為0分，神經(jīng)功能正常，造模后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，如不能完全伸展對側(cè)前爪，行走時向?qū)?cè)傾倒，損傷嚴(yán)重者不能行走，參照評分標(biāo)準(zhǔn)，造模第1天模型組和川芎嗪組mNSS行為學(xué)評分(分別15.0分、13.5分)與造模前比較，分?jǐn)?shù)均明顯增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模第3天川芎嗪組mNSS行為學(xué)評分(9.5分)與模型組(13.0分)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；造模第7 天川芎嗪組mNSS行為學(xué)評分(5.5分)與模型組(10.0分)比較，分?jǐn)?shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2TTC染色結(jié)果 經(jīng)TTC染色后，各組大鼠腦組織被染成紅色，梗死區(qū)域為白色。假手術(shù)組大鼠腦組織為紅色，結(jié)構(gòu)對稱性好；模型組鼠腦組織左側(cè)皮質(zhì)及紋狀體出現(xiàn)白色梗死區(qū)域；川芎嗪組梗死區(qū)域有所緩解，但仍可見白色梗死灶。見圖1。

注：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為川芎嗪組。

2.3各組大鼠腦組織梗死率比較 與TTC染色結(jié)果一致，與模型組比較，川芎嗪組梗死率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腦組織梗死率比較

2.4川芎嗪對大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)NO、MDA及SOD水平的影響 造模第7天，模型組腦組織NO和MDA水平[分別為(4.11±0.05)μmol/gprot、(5.58±0.28)nmol/mg]與假手術(shù)組[分別為(1.34±0.24)μmol/gprot、(0.89±0.04)nmol/mg]比較明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；川芎嗪組NO和MDA水平[分別為(2.55±0.11)μmol/gprot、(3.19±0.22)nmol/mg]較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；川芎嗪組SOD活水平[(73.52±3.84)U/mgprot]與模型組[(46.90±4.37)U/mgprot]比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5川芎嗪對大鼠腦組織Ca2+-ATP酶活性的影響 造模第7天，模型組大鼠腦組織Ca2+-ATP酶活性[(0.63±0.01)μmolpi/(mgprot·h)]與假手術(shù)組[(1.42±0.07)μmolpi/(mgprot·h)]比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ca2+-ATP酶活性降低可減弱細(xì)胞Ca2+外排，導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載，川芎嗪組Ca2+-ATP酶活性較模型組升高 [(1.46±0.10) μmolpi/(mgprot·h)]，改善細(xì)胞內(nèi)鈣超載狀況。

2.6川芎嗪對大鼠腦組織炎癥因子的影響 造模第7天，模型組各項炎癥因子基因相對表達(dá)水平與假手術(shù)組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；川芎嗪組TNF-α、IL-1、IL-6及IL-10基因相對表達(dá)水平與模型組比較均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 造模第7天川芎嗪對大鼠腦組織炎癥因子的影響

3 討 論

缺血性腦卒中是一種由多種機制參與的復(fù)雜的病理過程，缺氧導(dǎo)致的氧自由基的生成，細(xì)胞Ca2+調(diào)節(jié)失衡，進(jìn)而炎性反應(yīng)的激活等環(huán)節(jié)最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的壞死或凋亡。臨床上缺血性腦卒中首選治療方案為采用藥物或介入等方法進(jìn)行溶栓，盡快恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)，減少缺血面積，挽救半暗帶神經(jīng)細(xì)胞，最大限度減輕對腦組織結(jié)構(gòu)和功能的損傷。然而事實上溶栓治療易繼發(fā)再灌注損傷誘發(fā)氧自由基反應(yīng)進(jìn)而破壞血腦屏障的完整性，引起血管性腦水腫，促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤，造成更為嚴(yán)重的病理性損傷[4]。

近年來，川芎嗪及其衍生物作為中醫(yī)治療缺血性腦血管病的常用藥物，具有抗氧化、抗凋亡等功效，有研究表明川芎嗪可通過JNK/MARK信號通路抑制缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]；川芎嗪還可以通過升高SOD水平及降低MDA水平保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[5]；其衍生物川芎嗪硝酮易通過血腦屏障，減輕大鼠腦缺血后的腦梗死，保護(hù)和/或恢復(fù)神經(jīng)功能，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和少突膠質(zhì)生成[6]。本文也證實，川芎嗪可有效緩解大鼠MCAO模型神經(jīng)功能損傷狀態(tài)，減少梗死腦組織的體積，降低梗死率。然而，目前對川芎嗪治療機制的研究仍不全面，因此，本研究從氧自由基、Ca2+-ATP酶及炎性反應(yīng)等多個方面進(jìn)一步研究川芎嗪改善腦缺血再灌注損傷的作用機制，為川芎嗪的臨床治療提供實驗依據(jù)。

缺血再灌注損傷導(dǎo)致腦組織產(chǎn)生大量的氧自由基，其中NO是研究的熱點，缺血再灌注過程中NO水平呈現(xiàn)先升高后下降再升高的過程，內(nèi)皮細(xì)胞型NOS(eNOS)產(chǎn)生的NO在缺血早期具有保護(hù)神經(jīng)作用，但作用甚小，神經(jīng)元型NOS(nNOS)和誘導(dǎo)型NOS(iNOS)產(chǎn)生的NO對神經(jīng)組織有損傷，前者作用甚微，在病理狀態(tài)下，后者大量增加，產(chǎn)生過量的NO，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)毒作用，TARKOWSKI等[7]探討了急性腦卒中患者NO及其主要代謝產(chǎn)物與腦損傷的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)缺血早期NO具有一定保護(hù)作用，然而晚期NO具有明顯的神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損。MDA是脂質(zhì)氧化的最終產(chǎn)物，其水平變化可間接反映組織中氧自由基的變化，SOD作為主要的清除氧自由基的酶，對抗氧自由基對細(xì)胞損傷有重要作用[8-9]。本研究中大鼠在造模后，氧化應(yīng)激指標(biāo)NO和MDA水平明顯升高，SOD水平明顯降低，說明造模引起的缺血再灌注損傷激活了腦組織的氧自由基，氧化與抗氧化平衡破壞，川芎嗪治療后氧化指標(biāo)顯著下降，抗氧化指標(biāo)明顯提高，提示川芎嗪可有效調(diào)節(jié)損傷后腦組織的氧化平衡狀態(tài)，進(jìn)而降低氧自由基帶來的損傷作用，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Ca2+參與神經(jīng)細(xì)胞興奮、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等重要功能。鈣超載被認(rèn)為是各種有害因素導(dǎo)致神經(jīng)元變性的最后共同通道，可通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)、損傷線粒體等途徑引起神經(jīng)細(xì)胞死亡。正常神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+與細(xì)胞外相近，主要通過電壓依賴型鈣通道、Ca2+-ATP酶等維持Ca2+梯度。缺血時，細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致細(xì)胞膜Ca2+-ATP酶活性下降，細(xì)胞Ca2+內(nèi)流增加，外排減少，從而引起鈣超載[10]。本研究中川芎嗪可保護(hù)線粒體，提高Ca2+-ATP酶活性，促進(jìn)Ca2+排出，降低鈣超載狀態(tài)，保護(hù)神經(jīng)組織。

缺血再灌注損傷發(fā)生后，大量白細(xì)胞浸潤腦組織，產(chǎn)生炎癥因子進(jìn)而加重了腦損傷，已有大量實驗證明IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等細(xì)胞因子參與炎性反應(yīng)[11]，但有關(guān)川芎嗪對炎癥因子調(diào)節(jié)的報道較少見。本研究結(jié)果表明MCAO模型建立后大鼠腦組織中炎性反應(yīng)活躍，各類炎癥因子表達(dá)明顯增加，繼而造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷，川芎嗪各項炎癥因子基因相對表達(dá)水平均顯著下降，說明川芎嗪可通過抑制炎癥發(fā)生改善腦組織微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)，進(jìn)一步探究臨床川芎嗪治療腦卒中的作用機制。