楊鵬生，宋黎明，段希斌，梁馬可，梁占強(qiáng)，李學(xué)民

(鄭州市中心醫(yī)院肝膽胰腺外科，河南 鄭州 450000)

肝細(xì)胞肝癌(以下簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。研究表明，我國(guó)是全球肝癌發(fā)病數(shù)和病死數(shù)最多的國(guó)家，約占全球一半以上[1-3]。目前，治療肝癌的主要方法是手術(shù)切除，但術(shù)后患者5年生存率僅約為50%，其復(fù)發(fā)率高達(dá)70%。導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良的原因通常是缺乏有效的早期診斷[4-6]。因此，臨床亟須尋找一種與肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且能預(yù)測(cè)患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的新型指標(biāo)，從而為肝癌的早期診斷和治療提供新策略。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達(dá)具有組織特異性，在多種腫瘤中經(jīng)常表達(dá)失調(diào)，一些lncRNA與腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后不佳相關(guān)[7-8]。lncRNA被定義為長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本，一般來(lái)說(shuō)，約78%的lncRNA具有組織特異性。除了更高的組織特異性外，lncRNA還具有更高的發(fā)育階段特異性，以及在異質(zhì)組織(如人類(lèi)新皮層)中的細(xì)胞亞型特異性[9-10]。現(xiàn)有研究指出，lncRNA可作為癌癥患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，與癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)[11]。lncRNA NCK1-AS1是lncRNA家族成員之一，在宮頸癌、前列腺癌的相關(guān)研究中顯示，其表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)[12-13]。本研究通過(guò)分析lncRNA NCK1-AS1在肝癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)，探討其與臨床病理指標(biāo)、預(yù)后的關(guān)系，以期為肝癌的診斷提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年4月至2017年6月本院肝癌確診患者73例，其中男48例，女25例；年齡42～78歲，平均54.4歲。所有患者均按照世界衛(wèi)生組織中關(guān)于肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診，且在術(shù)前未接受過(guò)放化療。采集肝癌組織及配對(duì)的癌旁組織(癌旁組織取于距腫瘤病灶2 mm以上的肝癌組織)，放入凍存管進(jìn)行標(biāo)記，液氮貯存。根據(jù)肝癌組織中l(wèi)ncRNA NCK1-AS1表達(dá)水平將研究對(duì)象分為高表達(dá)組(33例)和低表達(dá)組(40例)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情且簽署知情同意書(shū)。術(shù)后對(duì)所有患者進(jìn)行上門(mén)或電話隨訪，隨訪時(shí)間為手術(shù)當(dāng)天至死亡當(dāng)天或隨訪截止日。

1.2方法 (1)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)lncRNA NCK1-AS1表達(dá)水平。利用Trizol法提取組織樣品或培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，lncRNA NCK1-AS1正向引物為5′-TTC CCA TTT CTC CCA GGT CC-3′，反向引物為5′-TGG TTA CTT TGA GCC TGC CT-3′；β-actin正向引物為5′-AGC CTC GCC TTT GCC GA-3′，反向引物為5′-CTG GTG CCT GGG GCG-3′；miR-361-5p正向引物為GGG AGG TTA TCA GAA TCT CCA GG，反向引物為CAG TGC GTG TCG TGG AGT；U6正向引物為5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，反向引物：5′-GGA ACG CTT CAC GAT TTG-3′。根據(jù)PCR試劑盒添加各組試劑配制熒光定量PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序采用兩步法，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以β-action/U6為參照基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA NCK1-AS1的相對(duì)表達(dá)水平。(2)lncRNA NCK1-AS1靶向基因預(yù)測(cè)。通過(guò)Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)lncRNA NCK1-AS1的靶向miR-361-5p，分析lncRNA NCK1-AS1與miR-361-5p表達(dá)的相關(guān)性。RNA提取試劑盒、Trizol試劑、熒光定量試劑盒均購(gòu)自上海百研生物科技有限公司；引物序列由北京六合華大基因科技有限公司合成；NanoDrop微量核酸測(cè)定儀購(gòu)自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司。

2 結(jié) 果

2.1肝癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA NCK1-AS1表達(dá)水平比較 肝癌組織組中l(wèi)ncRNA NCK1-AS1相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 肝癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA NCK1-AS1表達(dá)情況

2.2不同lncRNA NCK1-AS1表達(dá)水平組臨床病理參數(shù)比較 低表達(dá)組分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期情況與高表達(dá)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同lncRNA NCK1-AS1表達(dá)水平組臨床病理參數(shù)比較(n)

續(xù)表1 不同lncRNA NCK1-AS1表達(dá)水平組臨床病理參數(shù)比較(n)

2.3不同lncRNA NCK1-AS1表達(dá)水平組生存期比較 低表達(dá)組中位生存期為20個(gè)月，明顯高于高表達(dá)組的15個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4lncRNA NCK1-AS1與miR-361-5p表達(dá)的相關(guān)性分析 通過(guò)Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，lncRNA NCK1-AS1與miR-361-5p存在靶向調(diào)控位點(diǎn)，見(jiàn)圖2A。肝癌組織中miR-361-5p相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2B。lncRNA NCK1-AS1與miR-361-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r2=0.078 6，P<0.001)，見(jiàn)圖2C。利用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行l(wèi)ncRNA NCK1-AS1與miR-361-5p共表達(dá)分析，兩者呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)圖2D。

A為lncRNA NCK1-AS1與miR-361-5p的靶向序列信息；B為miR-361-5p在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)；C為lncRNA NCK1-AS1與miR-361-5p表達(dá)的相關(guān)性；D為lncRNA NCK1-AS1與miR-361-5p共表達(dá)分析。

3 討 論

肝癌惡性程度高、隱匿性強(qiáng)、進(jìn)展速度快，很多患者就診時(shí)已處于中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。另外，肝癌術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致5年生存率低。肝癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多步驟、多階段漸進(jìn)演化，囊括多種基因的異常表達(dá)和表觀遺傳學(xué)的變化[14]。既往研究顯示lncRNA可參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，可能通過(guò)DNA、RNA、蛋白質(zhì)3個(gè)方面參與復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。由于lncRNA的表達(dá)量或狀態(tài)均可作為效應(yīng)分子，其表達(dá)水平高低反映腫瘤性質(zhì)，故其與mRNA相比，是更好的腫瘤診斷層面標(biāo)志物[15]。lncRNA作為一種新型腫瘤標(biāo)志物，在肝癌組織發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控過(guò)程中具有不可小覷的作用，對(duì)深入探究肝癌的發(fā)病機(jī)制并制定有效的早期診斷及治療策略具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外研究表明，lncRNA NCK1-AS1在膀胱癌、卵巢癌、宮頸癌、鼻咽癌中發(fā)揮重要作用。lncRNA NCK1-AS1在宮頸癌中過(guò)表達(dá)，并通過(guò)與miR-134的相互作用促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移侵襲和細(xì)胞增殖[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NCK1-AS1促進(jìn)NCK1表達(dá)會(huì)抑制化療過(guò)程中化學(xué)耐藥性的發(fā)展，促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生[17]。有研究顯示，前列腺癌中l(wèi)ncRNA NCK1-AS1表達(dá)會(huì)上調(diào)，而沉默lncRNA NCK1-AS1抑制了這種作用，會(huì)抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞干性[18]。沉默lncRNA NCK1-AS1表達(dá)通過(guò)上調(diào)miR-135a抑制鼻咽癌癌細(xì)胞的遷移和侵襲[19]。lncRNA NCK1-AS1表達(dá)在肝癌中的作用研究鮮有報(bào)道。本研究利用qRT-PCR檢測(cè)肝癌患者肝癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA NCK1-AS1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中l(wèi)ncRNA NCK1-AS1表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，lncRNA NCK1-AS1表達(dá)與分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期等生物學(xué)行為相關(guān)，且lncRNA NCK1-AS1高表達(dá)患者預(yù)后較lncRNA NCK1-AS1低表達(dá)患者差。提示lncRNA NCK1-AS1可能成為肝癌預(yù)后的分子標(biāo)記物。通過(guò)Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，miR-361-5p可能為lncRNA NCK1-AS1潛在的靶向調(diào)控位點(diǎn)。肝癌患者miR-361-5p表達(dá)下調(diào)，其可通過(guò)靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲。miR-361-5p可通過(guò)抑制CXC趨化因子受體6表達(dá)而抑制肝癌細(xì)胞增殖，過(guò)表達(dá)miR-361-5p可顯著抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織miR-361-5p表達(dá)下調(diào)，lncRNA NCK1-AS1與miR-361-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此，lncRNA NCK1-AS1可能通過(guò)調(diào)控miR-361-5p表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。

綜上所述，肝癌組織中l(wèi)ncRNA NCK1-AS1呈高表達(dá)，與患者不良預(yù)后相關(guān)，其可能通過(guò)調(diào)控miR-361-5p表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。lncRNA NCK1-AS1可能會(huì)成為研究肝癌致病的分子機(jī)制之一，并可能成為肝癌診斷和預(yù)后判斷的新靶點(diǎn)。