金偉，劉丹丹，韓海明

（濰坊市益都中心醫(yī)院 消化內(nèi)科一病區(qū)，山東 濰坊 262500）

0 引言

結(jié)腸癌是目前常見的消化系統(tǒng)疾病之一，近年來發(fā)病率日益上升，目前該病發(fā)病率在全球居第四，這一疾病嚴重威脅著人類色生命健康及其安全，手術(shù)切除是該疾病的最好的手段，而相應的手術(shù)后的疾病的轉(zhuǎn)移及相應的輔助治療也是十分麻煩。而腫瘤的耐藥性及復發(fā)轉(zhuǎn)移，這也是引起相應患者死亡十分重要的原因之一。因此，如何更加完善的進行治療，這儼然已經(jīng)當前許多工作者研究的重點任務之一。順鉑為臨床一線抗癌化療藥物，但由于患者自身體內(nèi)的抗體藥物的毒副作用，其療效欠佳。研究發(fā)現(xiàn)化療藥物能激活腫瘤細胞的NF-κB，進而降低其療效，提示NF-κB的激活可能參與腫瘤細胞耐藥[1]，抑制化療藥物對NF-κB的激活能增強其療效。

槲皮素一種化學有機化合物，屬于黃酮類化合物，這一藥物廣泛的存在于相應的植物體內(nèi)，易于提取、分離及檢測。槲皮素有許多優(yōu)良的性質(zhì)，如：抗炎、抗腫瘤、抗血小板 凝集和心血管等在內(nèi)的許多作用，特別是能夠抑制許多相應細胞數(shù)量的增值，需要重點研究的是逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞及其所對應的抗藥性，藥耐藥性及增強其他抗腫瘤藥物作用的敏感性[2]，并可通過抑制NF-κB激活發(fā)揮抗腫瘤作用。我們應該以結(jié)腸癌HT-29細胞株對應的靶細胞，探討槲皮素聯(lián)合順鉑對人結(jié)腸癌的相應的效果，并很好的進行相應的檢測分析，結(jié)果是檢測NF-κB的表達探討其分子生物學機制。

1 材料和方法

1.1 材料。結(jié)腸癌HT-29細胞來自人結(jié)腸癌細胞系，購自上海信裕生物科技有限公司；槲皮素（quercetin，Qu），該商品買自美國Sigma公司，純度為99.5%；順鉑購自Sigma公司，小牛血清的采購來自于杭州四季青生物工程材料對應的研究機構(gòu)；RPMI1640培養(yǎng)基采買于Gibco公司；MTT采買于Sigma公司；兔抗NF-κBp65亞單位等相應的抗體等產(chǎn)品等采買于Santa Cruz公司；免疫細胞結(jié)構(gòu)及其化學SP試劑，結(jié)合相應的DAB顯液采買于福州邁新生物技術(shù)公司，未具體提到的其他試劑均為相應的分析類的試劑樣品。

1.2 方法。細胞培養(yǎng)的常規(guī)路徑是將其處于RPMI1640中，該培養(yǎng)基中包含有相應的小牛血清含量為10 mL/L，青霉素含量為100 kU/L，鏈霉素含量為100 mg/L，置37℃，50 mL/LCO2孵箱中長期進行培養(yǎng)。取對數(shù)不同生長周期的細胞將其置于對應的實驗條件之下，進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)后的細胞用于后續(xù)大的細胞實驗生產(chǎn)。將槲皮素和順鉑以不同的研究內(nèi)容及研究形式進行分類，得到的相應的細胞種類進行不同程度的分類，主要可以分為：槲皮素組，順鉑組，槲皮素與順鉑聯(lián)合組。實驗時將溶解于培養(yǎng)液中的藥物（槲皮素以DMSO預溶）加入培養(yǎng)細胞的新鮮培養(yǎng)液中，使藥物濃度達到：槲皮素組12.5，25，50μmol/L，（其中培養(yǎng)基中的DMSO含量不會超過5 g/L）；順鉑組，0.1，1，10 mg/L；聯(lián)合組，槲皮素為50μmol/L和順鉑為10 mg/L。

1.2.1 MTT試驗：培養(yǎng)生長周期為HT-29細胞，將其接種到96孔培養(yǎng)板之上，每孔含有1×104個細胞，培養(yǎng)24 h后進行細胞組織液的更換，之后加入藥物，使其含量達到：槲皮素組，分別為12.5，25，50μmol/L；順鉑組，分別為0.1，1，10 mg/L；聯(lián)合組，槲皮素為50μmol/L和順鉑為10 mg/L。每組此外再額外加設4個復孔，在此基礎上再加設對應的溶劑培養(yǎng)對照組，在此基礎上接著培養(yǎng)12，24，48 h，其每孔需要加入5 g/L的MTT20μL，接著需要在培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，之后將其全部倒盡板中，在每孔之上需要更換其上的培養(yǎng)液，每孔分別加入150μLDMSO溶液，在此基礎上連續(xù)振蕩10 min，是培養(yǎng)皿中的對應的結(jié)晶物在此中完全充分溶解，用酶標儀再去測定各孔不同的參數(shù)，如；吸光度（A）值，再以各孔數(shù)值的均值作為平均值。根據(jù)所對應的相應的計算公式進行計算，如計算抑制率：（1-實驗組A/對照組A）×100%。

1.2.2 流式細胞儀分析：收集藥物處理24 h后的細胞，PBS洗后，用70 mL/L對應的乙醇溶液進行固定，4℃保存，染色前離心、之后需要經(jīng)過沉淀離心，之后再此基礎上再加入RnaseA及相應的碘化丙啶進行深度混合，避光30 min，之后再去檢測對應的細胞儀，用于各種不同情況下細胞對應的凋亡率，以及相應的各細胞周期對應所占的不同百分比。

1.2.3 NF-κB蛋白檢測：將預先消毒好的蓋玻片放入12孔培養(yǎng)板中，將細胞濃度調(diào)整至1×107個/L，每孔加1 mL，置CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，吸出舊培養(yǎng)液，在此基礎上分別加入順鉑10 mg/L，而后再繼續(xù)培養(yǎng)約10h之久。并在此基礎上建立相應的陰性對照組，將其培養(yǎng)到預定時間之后，將相應碎片取出，再將其培養(yǎng)至額定時間培養(yǎng)至預定時間將玻片取出，PBS洗后，4℃丙酮固定，而后將其樣品取出，對其進行晾干固定，將其置于溫度4℃濕盒之中，連續(xù)存儲，以備用。采用SP染色法，DAB顯色。蘇木素復染，將其進行脫水，在此后進行透明化處理，并在相應的照片中保存觀察，便于存儲。結(jié)果判斷：每張圖片在相應的高倍顯微鏡下進行隨機統(tǒng)計，總數(shù)量達2000個細胞，并在此基礎上計算相應的陽性細胞數(shù)目的百分率。NF-κBp65抗體染色陽性細胞是一種單細胞核生物，此中會出現(xiàn)相應的顏色，如：棕黃色顆粒，以及相應的細胞核顏色進行著重處理。

1.3 統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)取自3次以上，實驗結(jié)果的表述用“”表示，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用SPSS 13.0軟件深入對其相應的單因素進行深入的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測結(jié)果。槲皮素組，順鉑組及槲皮素與順鉑實驗組下對結(jié)腸癌細胞處理后，結(jié)腸癌細胞增殖被有效的得到抑制，根據(jù)本實驗的數(shù)據(jù)結(jié)果的統(tǒng)計分析，可看到聯(lián)合用藥對結(jié)腸癌細胞的抑制情況高于單獨使用順鉑，而槲皮素抑制作用最弱，且三組藥物的藥性隨時間延長也越發(fā)增強，見表1。

表1 藥物對結(jié)腸癌HT-29細胞的抑制作用（，A）

表1 藥物對結(jié)腸癌HT-29細胞的抑制作用（，A）

注：a P＜0.05，b P＜0.01vs對照組。

2.2 流式細胞儀結(jié)果。HT-29細胞經(jīng)過上述3組藥物進行聯(lián)合治理之后，連續(xù)作用時間長超過24 h后，G1期前十分清晰顯著凋亡峰曲線。凋亡細胞相應的凋亡率是最高（14.3±2.6）%，其凋亡率顯著高于順鉑組（8.5±2.0）%（P＜0.01）及槲皮素組（4.5±2.2）%（P＜0.01）。細胞周期，經(jīng)過相應的藥物聯(lián)合處理24 h后，G2/M期細胞比率上升的比較+上升，G0/G1期細胞比率下降，表明細胞周期變化比較急促，被阻滯于G2/M期，實驗結(jié)果表明聯(lián)合處理的實驗組G2/M期細胞比率相對較為明顯，且有實驗數(shù)據(jù)結(jié)果十分具有一定的統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 藥物對細胞凋亡生命軌跡及其細胞周期的影響（，%）

表2 藥物對細胞凋亡生命軌跡及其細胞周期的影響（，%）

注：aP＜0.05，bP＜0.01，vs槲皮素。

2.3 NF-κB表達的變化。HT-29細胞經(jīng)順鉑10 mg/L和聯(lián)合組：槲皮素為50μmol/L和順鉑為10 mg/L作用10 h，NF-κB胞核染色陽性率順鉑組（63.8±5.6）%明顯高于聯(lián)合組（23.2±2.3）%（P＜0.01），表明順鉑激發(fā)HT-29細胞NF-κB高表達，而槲皮素與順鉑聯(lián)合明顯抑制NF-κB的表達（Fig3），單用HT-29作用10h，NF-κB胞核染色陽性率(16.8±4.5)%低于對照組(22.8±5.8)%（P＜0.05）。

3 討論

誘導腫瘤細胞凋亡方法是當前臨床使用的主要治療手段及治療方法。其中相應的情況下的化療藥物激活對應的NF-κB轉(zhuǎn)錄，這也是間接誘導其產(chǎn)生耐藥性主要原因，這一結(jié)果可以十分有效的抑制NF-κB的表達，此外還可以增強相應的化療療效主要方法之一。槲皮素廣泛分布于于各種植物中，易于提取、分離及檢測，在人體內(nèi)幾乎無毒性，具有有抗炎、抗腫瘤、抗血小板凝集和心血管保護等多種藥理作用。槲皮素作為一種低毒有效的藥物，該藥物可單獨作用，并可以誘發(fā)相關(guān)腫瘤細胞凋亡[3]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可有效抑制NF-κB的激活，在此基礎上進而誘導腫瘤細胞凋亡[4]。在此階段可以有效的抑制NF-κB的表達，在此階段可以有效的增強相應的化學生物藥的療效，在此基礎上對相應的藥物耐藥途徑進行分類比較及篩選。我們以人結(jié)腸癌HT-29細胞株相應的實驗數(shù)據(jù)進行分析探索，研究表明通過免疫細胞化學的方法進行深入數(shù)據(jù)的檢測，NF-κB在結(jié)腸癌HT-29細胞株三組藥物作用后的表達，用NF-κB胞核染色陽性率反映NF-κB表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑10mg/L作用細胞10h后NF-κB表達增高，實驗結(jié)果與Cipak等[5]研究現(xiàn)象進一步發(fā)現(xiàn)槲皮素對相應的實驗對象HL60和LI210白血病細胞進行預處理，發(fā)現(xiàn)能增強相應的順鉑對其細胞凋亡的作用，同時槲皮素，結(jié)合相應的順鉑一起使用，其相應的協(xié)同效果應該與近些年的報道結(jié)果相一致.對應的聯(lián)合組：槲皮素為50μmol/L和順鉑為10 mg/L作用10h后NF-κB表達明顯減弱，結(jié)果與王立忠等[6]對槲皮素聯(lián)合化療藥物在肺癌中的結(jié)果一致。我們證實槲皮素通過抑制激活NF-κB的表達可增強順鉑的療效。槲皮素具有相應的毒副作用，其相應的普及程度十分廣泛，普及價格也十分低廉，十分有助于當前臨床聯(lián)合化療，局部或全身都可使用，為治療結(jié)腸癌提供更加安全、有效的手段。