陳曦 朱悅瑩 施典羽 顏帥 湯國棟 鄒宇

1廣東省婦幼保健院耳鼻咽喉科（廣州511400）；2深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（廣東深圳518109）

鼻咽癌是我國南方地區(qū)尤其是廣東省高發(fā)的腫瘤之一，占頭頸部腫瘤發(fā)病率首位。鼻咽癌的重要臨床特點是易發(fā)生局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達(dá)70%以上［1-2］，有約30% ～40%的鼻咽癌患者由于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)未能長期生存。HOTAIR是被發(fā)現(xiàn)的第一個有反式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用并影響其他染色體基因轉(zhuǎn)錄的LncRNA［3］，HOTAIR的高表達(dá)與包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多個惡性腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)［4-6］。最新研究表明HOTAIR 在鼻咽癌中表達(dá)水平升高，與鼻咽癌的T 分期和N 分期密切相關(guān)，提示HOTAIR 的高表達(dá)可能與鼻咽癌的增殖轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［7］，然而目前有關(guān)HOTAIR 在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的研究較少，相關(guān)機制尚未明確。前期通過軟件分析發(fā)現(xiàn)HOTAIR 在miR-30 家族中有多個調(diào)控位點。研究顯示miR-30 家族成員在鼻咽癌組織中較癌旁正常組織表達(dá)下降［8-9］，根據(jù)生物信息學(xué)分析，本研究選擇miR-30d 作為HOTAIR 的調(diào)控目標(biāo)，研究兩者的作用可能對鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白帶來的影響，以期進(jìn)一步闡明該疾病的轉(zhuǎn)移機制，有望建立更有效的靶向治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞購自廣州索友百生物科技有限公司，HOTAIR siRNA、miR-30d mimics和miR-30d inhibitor 及相應(yīng)對照組由上海吉瑪生物制藥有限公司合成，cDNA 合成及定量PCR 試劑盒購自Takara 公司，Anti-Vimentin（3932S）和Anti-E-cadherin（14472S）抗體購自Cell signal technology公司，Anti-GRP78（H-129）抗體購自Santa cruz 公司，熒光素酶檢測試劑盒（E1910）購自Promega 公司，熒光素酶報告載體由上海欣基生物科技有限公司構(gòu)建，Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。HOTAIR 上游5′-CCACAUGAACGCCCAGAGAUUTT-3′，下游5′-GAACGGGAGUACAGAGAGAUU-3′；miR-30d 上游5′-GGGTGTAAACATCCCCGACT-3′，下游5′-CGTATCCAGTGCGTGTCGTG-3′；GAPDH 上游5′-TGGCACCCAGCACAATGA A-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCG CCTAGAAGCA-3′；U6 上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCRTrizol 法抽提細(xì)胞總RNA，純度檢測合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒進(jìn)行定量PCR 檢測，PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃34 s，40 個循 環(huán)；HOTAIR 和miR-30d 分 別 以GAPDH 和U6 作為內(nèi)參。

1.2.2 Transwell 法檢測CNE-2 細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將各研究組細(xì)胞配制成濃度為1 × 106/mL 的單細(xì)胞懸浮液，將100 μL 的細(xì)胞懸浮液添加到Transwell 小室的上室中，在下室中添加含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃孵育24 h，用棉簽將沒有穿膜的細(xì)胞擦掉，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下隨機選取5 個視野分析細(xì)胞遷移數(shù)目；侵襲實驗步驟同上，在侵襲實驗前用基質(zhì)膠將小室濕化。

1.2.3 Western blot 檢測蛋白表達(dá)提取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行定量，按每1 μL 樣品加入0.25 μL 上樣緩沖液的比例混合，沸水加熱變性5 min，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后遷移至硝酸纖維素膜，加入5 g脫脂奶粉與100 mL TBST配成的封閉緩沖液，置于振蕩培養(yǎng)箱中26 ℃封閉2 h，洗膜后分別加入E-cadherin，vimentin（1∶500）及GRP78 一抗（1∶250），4 ℃孵育過夜；再分別用辣根過氧化酶標(biāo)IgG 抗體（1∶1 500）二抗雜交，GAPDH 作為內(nèi)參，比較目的條帶灰度值，實驗重復(fù)3 次。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因檢測將HOTAIR 結(jié)合序列突變，分別構(gòu)建突變型（pmiRGLO-HOTAIRMUT）和野生型熒光素酶報告載體（pmiRGLO-HOTAIR-WT）。將HOTAIR-MUT 和HOTAIR-WT 與miR-30dmimics 和mimics control 共轉(zhuǎn)染至CNE-2 細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h 后檢測熒光素酶活性。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組按轉(zhuǎn)染試劑說明書要求將HOTAIR siRNA 和siRNA control 轉(zhuǎn)染至CNE-2 細(xì)胞中，把轉(zhuǎn)染HOTAIR siRNA 和siRNA control 后的細(xì)胞設(shè)置為si-HOTAIR 組和si-con 組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞設(shè)為control 組。RT-qPCR 檢測轉(zhuǎn)染效率；設(shè)置轉(zhuǎn)染miR-30d mimics 和mimics control 后 的CNE-2 細(xì)胞為miR-30d 組和miR-NC 組，RT-qPCR 檢測兩組細(xì)胞miR-30d 的表達(dá)；同時用RT-qPCR 檢測control、si-con、si-HOTAIR、vector（轉(zhuǎn)染陰性對照載體pcDNA3.1）和HOTAIR（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HOTAIR）各組細(xì)胞中miR-30d 的表達(dá)，U6 作為內(nèi)參。在CNE-2 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染HOTAIR siRNA 和miR-30d inhibitor，命名為si-HOTAIR+anti-miR-30d 組；共轉(zhuǎn)染HOTAIR siRNA 和inhibitor control，命名為si-HOTAIR+anti-NC 組，用RT-qPCR、Western blot 以及Transwell 法檢測CNE-2 細(xì)胞中相關(guān)基因蛋白的表達(dá)及侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差分析，組間比較用SNK 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)HOTAIR 抑制CNE-2 細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)目及GRP78 和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)RT-qPCR 檢測HOTAIR 轉(zhuǎn)染效率，CNE-2 細(xì)胞中si-HOTAIR 組HOTAIR基因表達(dá)水平明顯低于si-con組（P＜0.05），見圖1A。與si-con 組相比，si-HOTAIR 組CNE-2 細(xì)胞的侵襲和遷移數(shù)目明顯降低，同時細(xì)胞中上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物E-cadherin 水平升高，間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志物vimentin 水平降低，GRP78 表達(dá)下降（P＜0.05），見圖1B、C。

圖1 下調(diào)HOTAIR 后CNE-2 細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)目及相關(guān)蛋白表達(dá)變化Fig.1 The change of the invasion and migration number of CNE-2 cells and the expression of related proteins after down-regulation of HOTAIR

2.2 HOTAIR 靶向負(fù)調(diào)控miR-30d 的表達(dá)根據(jù)RNA22 version 2.0 預(yù)測 的HOTAIR 和miR-30d 靶 向結(jié)合位點（圖2A），轉(zhuǎn)染miR-30d mimics 后，細(xì)胞中的miR-30d 表達(dá)升高（圖2B），HOTAIR-WT 和miR-30d mimics 共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性降低（圖2C），在CNE-2 細(xì)胞中si-HOTAIR 組miR-30d 的表達(dá)水平明顯高于si-con 組；HOTAIR 組miR-30d 的表達(dá)水平明顯低于vector 組（圖2D）；結(jié)果顯示HOTAIR 可以負(fù)向調(diào)控miR-30d 的表達(dá)。

圖2 HOTAIR 靶向負(fù)調(diào)控miR-30d 的表達(dá)Fig.2 HOTAIR negatively regulates the expression of miR-30d specifically

2.3 下調(diào)miR-30d逆轉(zhuǎn)敲減HOTAIR對CNE-2細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)目及EMT相關(guān)蛋白的影響CNE-2細(xì)胞中si-HOTAIR＋anti-miR-30d 組miR-30d 的表達(dá)水平明顯低于si-HOTAIR+anti-NC 組（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染miR-30d inhibitor 后明顯抑制miR-30d的表達(dá)（圖3A）。與si-HOTAIR+anti-NC 組相比，si-HOTAIR+anti-miR-30d 組在CNE-2 細(xì)胞中的侵襲和遷移數(shù)目增加（圖3B），免疫印跡結(jié)果顯示vimentin 和GRP78 表達(dá)增加，E-cadherin 表達(dá)下降（圖3C）。

3 討論

鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移涉及多個基因和信號通路的改變，HOTAIR 在許多腫瘤的發(fā)生進(jìn)展中起重要作用，介導(dǎo)了包括肺癌、胃癌等多種癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［10-11］。本實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)HOTAIR 表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力降低，這與其它腫瘤的研究結(jié)果一致，提示HOTAIR 可能是腫瘤侵襲促進(jìn)因子。有研究顯示其表達(dá)與鼻咽癌放療效果不佳呈正相關(guān)，可作為評估腫瘤進(jìn)展和患者生存率的獨立預(yù)后指標(biāo)［12］。一些異常表達(dá)的LncRNA與相關(guān)miRNA 的相互作用被證實是鼻咽癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要分子生物學(xué)基礎(chǔ)［13-14］，miR-30d 是miR-30家族的六個成員之一，在多個類型的人類上皮腫瘤研究發(fā)現(xiàn)miR-30d 表達(dá)的調(diào)節(jié)異常［15-16］，證實miR-30d 通過調(diào)控GNA13 在抑制結(jié)直腸癌的增殖和侵襲中發(fā)揮了重要的作用［17］。事實上大部分LncRNA 都可以作為競爭性內(nèi)源RNA 發(fā)揮海綿效應(yīng)抑制miRNA，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游蛋白表達(dá)［18］。

腫瘤細(xì)胞遷移的關(guān)鍵步驟是細(xì)胞的遷移運動，部分上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT），細(xì)胞間緊密連接被破壞，黏附減弱，運動増強，使細(xì)胞獲得了游走的能力。GRP78 是一類調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡與血管生成的蛋白，在鼻咽癌細(xì)胞中沉默GRP78，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞對去離子輻射和順鉑的抵抗力下降［19］。FU 等［20］在鼻咽癌細(xì)胞和標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)HOTAIR 可以通過靶向GRP78 介導(dǎo)的VEGFA 和Ang2 表達(dá)上調(diào)來促進(jìn)腫瘤血管的生成，這可能是促進(jìn)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制之一。綜上所述，本研究表明HOTAIR 可以通過miR-30d 調(diào)節(jié)GRP78 和EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)，并有利于促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與遷移。下一步將深入研究miR-30d 與GRP78 和EMT 相關(guān)蛋白之間的關(guān)系進(jìn)一步闡明其具體調(diào)控機制。

圖3 miR-30d inhibitor 逆轉(zhuǎn)敲減HOTAIR 對CNE-2 細(xì)胞侵襲、遷移及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The miR-30d inhibitorreversedtheeffectsof HOTAIR knock-down oninvasion，migration abilities of CNE-2 cells and the expression of related protein