楊建環(huán) 王德選 陳敏廣 邢超

兒童原發(fā)性腎病綜合征主要表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和水腫，微小病變型是最常見的病理類型[1]。目前原發(fā)性腎病綜合征的發(fā)病機(jī)制尚不明確，機(jī)體免疫功能紊亂可能參與疾病的發(fā)生。?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase，ACAT）是一種細(xì)胞內(nèi)催化膽固醇代謝的酶，它將細(xì)胞內(nèi)游離的膽固醇催化為膽固醇酯的形式并儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，從而維持細(xì)胞膜的膽固醇穩(wěn)態(tài)[2]。目前已鑒定出兩個(gè)ACAT基因（ACAT1和ACAT2），其中ACAT1廣泛表達(dá)，ACAT2主要表達(dá)于肝臟和小腸[3]。研究發(fā)現(xiàn)ACAT1表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致脂質(zhì)在慢性腎臟病大鼠的腎臟中沉積；而腎臟中脂質(zhì)積聚可加速腎臟疾病的進(jìn)展[4]。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，通常發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島上。研究發(fā)現(xiàn)，基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)通常與基因轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)，而去甲基化狀態(tài)則與基因轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化異常影響著基因的表達(dá)和疾病的發(fā)展。而多項(xiàng)研究表明腎病綜合征的發(fā)病可能與表觀遺傳改變有關(guān)[6-7]；筆者團(tuán)隊(duì)前期研究也發(fā)現(xiàn)腎病綜合征患兒的基因組總體甲基化水平降低[8]。目前有關(guān)DNA甲基化異常是否影響腎病綜合征患兒ACAT1基因表達(dá)的研究不多。基于此，本研究通過分析腎病綜合征患兒ACAT1基因啟動(dòng)子的甲基化水平，探討ACAT1甲基化異常在兒童腎病綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018年6月至2019年12月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的原發(fā)性腎病綜合征患兒16例，為腎病組，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）蛋白尿：尿白蛋白＞50 mg/（kg·d），或隨機(jī)尿白蛋白/尿肌酐＞2 mg/mg；（2）低蛋白血癥：血清白蛋白＜25 g/L；（3）激素治療敏感：4 周內(nèi)緩解；（4）年齡＜16周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）先天性或遺傳性腎病綜合征；（2）繼發(fā)性腎病綜合征（過敏性紫癜腎炎、狼瘡性腎炎等）。另?yè)裢瑫r(shí)期來醫(yī)院體檢的健康兒童16例為對(duì)照組。兩組患兒性別、年齡、WBC、Hb、PLT、血尿素氮、血肌酐水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），腎病組患兒血漿白蛋白水平低于對(duì)照組（P＜0.05），膽固醇水平、尿白蛋白/尿肌酐高于對(duì)照組（均P＜0.05），見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)研究對(duì)象家屬知情同意。

表1 兩組患兒一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 ACAT1基因啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè) 采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法。取患兒外周靜脈血1 ml，用血液基因組DNA提取試劑盒（中國(guó)天根生物有限公司）提取全血基因組DNA（操作過程參考說明書）。采用德國(guó)Qiagen公司EpiTect bisulfite kit試劑盒對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾（操作過程參考說明書）。經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后，非甲基化的DNA序列中所有的脫氧胞嘧啶（C）均被轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跄蜞奏ぃ║）；而甲基化CpG島中的脫氧胞嘧啶（C）不會(huì)被亞硫酸氫鈉反應(yīng)，仍然保持CpG序列。將轉(zhuǎn)化后的DNA模板送檢上海生工生物公司測(cè)序，檢測(cè)ACAT1基因啟動(dòng)子的甲基化水平。

1.2.2 ACAT1及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 取患兒外周靜脈血1 ml，采用Ficoll法提取外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞，采用Trizol法提取單個(gè)核細(xì)胞的總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。qPCR法檢測(cè)ACAT1 mRNA及Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)體系20 μl，包括10 μl FastStart Universal SYBR Green Master的PCR反應(yīng)試劑（瑞士Roche公司）、每個(gè)引物各1 μl（300 nmol/L）、2 μl cDNA 模板和 6 μl去離子水，并在 Roche LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀器中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性 5 min，95℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃20 s，共40個(gè)循環(huán)。所有樣本均設(shè)置兩個(gè)副管，以βactin作為內(nèi)參，引物設(shè)計(jì)見表2。數(shù)據(jù)結(jié)果以2-ΔCt相對(duì)定量表示。

表2 引物設(shè)計(jì)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎病組患兒和對(duì)照組兒童ACAT1 mRNA表達(dá)水平比較 腎病組患兒和對(duì)照組兒童ACAT1 mRNA表達(dá)水平分別為0.14±0.02和0.07±0.01，腎病組高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖1。

圖1 腎病組患兒和對(duì)照組兒童?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（ACAT1）mRNA 表達(dá)水平比較

2.2 腎病組患兒和對(duì)照組兒童ACAT1基因啟動(dòng)子的甲基化水平比較 BSP測(cè)序結(jié)果顯示ACAT1基因啟動(dòng)子中共有26個(gè)CpG島，腎病組患兒和對(duì)照組兒童ACAT1基因啟動(dòng)子的甲基化水平分別為2.36±0.58和4.76±0.81，腎病組低于對(duì)照組（P＜0.05），見圖2。

圖2 腎病組患兒和對(duì)照組兒童?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（ACAT1）基因啟動(dòng)子的甲基化水平比較

2.3 腎病組患兒和對(duì)照組兒童Dnmt mRNA表達(dá)水平比較 腎病組患兒和對(duì)照組兒童Dnmt1 mRNA表達(dá)水平分別為 0.05±0.01 和 0.09±0.01（P＜0.05），Dnmt3a mRNA表達(dá)水平分別為 0.07±0.01和 0.06±0.01（P＞0.05），Dnmt3b mRNA 表達(dá)水平分別為 0.08±0.01 和0.06±0.01（P ＞0.05），見圖3；提示腎病組患兒 ACAT1基因啟動(dòng)子的低甲基化水平可能與Dnmt1 mRNA表達(dá)水平降低有關(guān)。

圖3 腎病組患兒和對(duì)照組兒童DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（Dnmt）mRNA表達(dá)水平比較

2.4 ACAT1甲基化水平、mRNA表達(dá)水平與膽固醇水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，ACAT1甲基化水平與膽固醇水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.39，P＜0.05），ACAT1 mRNA表達(dá)水平與膽固醇水平呈正相關(guān)（r=0.36，P＜0.05），見圖4-5。由于腎病組患兒存在高膽固醇血癥，推測(cè)腎病綜合征患兒的膽固醇代謝異?？赡芘cACAT1基因表達(dá)異常相關(guān)。

圖4 ?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（ACAT1）甲基化水平與膽固醇水平的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

圖5 ?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（ACAT1）mRNA表達(dá)水平與膽固醇水平的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

3 討論

原發(fā)性腎病綜合征并發(fā)癥包括動(dòng)脈粥樣硬化和血栓栓塞，可能與機(jī)體脂質(zhì)代謝失調(diào)和血脂異常有關(guān)[9]。ACAT可促使膽固醇的酯化，在維持細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)中起重要作用[10]。ACAT1表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成，加速腎臟疾病的進(jìn)展[11]。本研究發(fā)現(xiàn)腎病組患兒ACAT1 mRNA表達(dá)水平升高，可能與腎病綜合征患兒脂質(zhì)代謝異常及高膽固醇有關(guān)；同時(shí)ACAT1表達(dá)水平升高可調(diào)節(jié)T細(xì)胞的膽固醇代謝，促進(jìn)CD8+T的增殖，影響機(jī)體T細(xì)胞的免疫狀態(tài)[12]，從而參與腎病綜合征的免疫功能紊亂。然而，本研究是基于臨床病例對(duì)照的研究，可能存在抽樣誤差，還需要進(jìn)一步大樣本論證。

DNA甲基化通常發(fā)生在CpG二核苷酸的5'側(cè)胞嘧啶上，而絕大多數(shù)CpG位點(diǎn)在細(xì)胞的整個(gè)周期中保持著甲基化狀態(tài)[13-14]。基因組中富含CpG位點(diǎn)的片段稱為CpG島，主要處于啟動(dòng)子區(qū)域，而CpG島的甲基化狀態(tài)可直接導(dǎo)致相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄沉默[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在ACAT1基因啟動(dòng)子中有4個(gè)Sp1元件和1個(gè)IFN-γ激活序列[16]。其中IFN-γ是一種促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的細(xì)胞因子，它通過與IFN-γ激活序列結(jié)合可上調(diào)單核巨噬細(xì)胞ACAT1 mRNA表達(dá)[17]，但對(duì)其它類型細(xì)胞則無此作用。本研究發(fā)現(xiàn)腎病綜合征患兒ACAT1基因啟動(dòng)子中有26個(gè)CpG島，相對(duì)于對(duì)照組，其ACAT1基因啟動(dòng)子甲基化水平降低。由于DNA甲基化通常與基因轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)，而去甲基化則與基因轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，因此推測(cè)腎病綜合征患兒ACAT1基因啟動(dòng)子的低甲基化水平可能與ACAT1 mRNA表達(dá)水平升高相關(guān)。

Dnmt是體內(nèi)催化DNA胞嘧啶殘基甲基化的主要反應(yīng)酶，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要包括Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b，它們之間具有協(xié)同作用，維持體內(nèi)DNA甲基化穩(wěn)定[18]。在正常成人中Dnmt1呈持續(xù)性的低表達(dá)狀態(tài)[19]，從而使人體內(nèi)部分基因呈去甲基化狀態(tài)。既往研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病db/db小鼠腎皮質(zhì)中Dnmt1而非Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表達(dá)水平升高[20]。本研究發(fā)現(xiàn)腎病組患兒Dnmt1 mRNA表達(dá)水平降低，而Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此筆者推測(cè)原發(fā)性腎病綜合征患兒ACAT1基因啟動(dòng)子的低甲基化水平可能與Dnmt1mRNA的表達(dá)水平降低相關(guān)。

綜上所述，腎病綜合征患兒ACAT1基因啟動(dòng)子呈低甲基化狀態(tài)，可能與Dnmt1 mRNA表達(dá)下調(diào)有關(guān)，從而使膽固醇代謝出現(xiàn)異常。這為臨床治療兒童原發(fā)性腎病綜合征提供新的思路。