曾雪華， 吳 剛， 祁永健

(江蘇省中醫(yī)院南院呼吸科，江蘇省南京市 210029)

肺癌是臨床常見的胸部惡性腫瘤，占到所有癌癥新發(fā)病例的17%，也是腫瘤遠處轉移和患者死亡的首要原因。近年來肺癌發(fā)病率呈現逐年升高的趨勢，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占到原發(fā)性肺癌總數的80%～85%，其中近三分之二患者確診時已處于中晚期，因此早期診斷和盡早治療成為改善肺癌患者預后的重中之重[1]。研究顯示協(xié)同刺激因子和相關調節(jié)網絡在免疫應答反應過程中具有重要作用，表達異常則與腫瘤免疫逃逸之間關系密切，程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1,PD-L1)屬于協(xié)同刺激分子超家族主要成員，會造成人體免疫抑制微環(huán)境抑制T、B淋巴細胞功能，造成腫瘤細胞惡性增殖[2]。本研究分析了PD-L1在NSCLC組織中表達特點及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預后的相關性，以期為臨床提供依據，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性選取本院病理科收集的2016年1月—2017年1月90例NSCLC組織(NSCLC組)、40例癌旁正常肺組織作為癌旁正常組。NSCLC組，男56例、女34例，年齡41～78歲，平均(62.7±10.8)歲，90例NSCLC患者病理學分期依據國際抗癌聯盟第8版腫瘤淋巴結轉移(tumor node metastasis，TNM)分期標準：Ⅰ期患者20例、Ⅱ期患者27例、Ⅲ期患者30例、Ⅳ期患者13例；發(fā)生淋巴結轉移60例；腫瘤直徑≥5 cm 17例。癌旁正常組，男23例、女17例，年齡44～75歲，平均(60.8±11.8)歲。

1.2 納入和排除標準

納入標準：①NSCLC患者的診斷依據《外科學》人民衛(wèi)生出版社第八版；②患者年齡19～79歲；③肺癌組織均經過病理學檢查證實；④本研究獲得醫(yī)學倫理委員會的批準。排除標準：①轉移性肺癌；②術后復發(fā)性肺癌；③獲取癌組織標本前具有放化療病史；④臨床資料、病歷資料缺失，難以納入統(tǒng)計分析。

1.3 免疫組化染色

制作石蠟切片、烤片待用，常規(guī)二甲苯脫蠟并水化，阻斷滅活內源性過氧化酶，隨后進行抗原修復，采用檸檬酸緩沖液作為抗原修復液，在切片加入10%正常山羊血清封閉，清除血清后甩去緩沖液，加入0.04%二氨基聯苯胺、0.03%過氧化氫溶液顯色，采用雙蒸餾水沖洗終止染色，蘇木精復染30 s后使用雙蒸餾水沖洗脫水透明，顯微鏡下進行觀察。PD-L1試劑盒由上海潤裕生物科技有限公司提供，克隆號22C3。

1.4 免疫組化結果判定

免疫組化染色切片的結果判定：PD-L1蛋白主要在NSCLC癌細胞的細胞膜、細胞質中表達。①依據染色深淺程度進行評分：0分、1分、2分、3分分別對應無著色、淡黃色、棕黃色、褐色甚至黑色；②依據染色細胞的占比情況進行評分：陽性染色細胞占比≤10%則評為1分、染色細胞比例范圍10%～50%評為2分、染色細胞占比范圍50%～75%評為3分、當染色細胞占比>75%評分為4分。蛋白染色深淺評分及染色細胞占比評分相乘為免疫組化染色的總分，<3分為陰性“-”；3～5分為陽性“+”；6～9分為較強陽性“++”；>9分為強陽性“+++”。

1.5 PD-L1蛋白陽性判定及隨訪

分析NSCLC病灶組織標本中的PD-L1蛋白表達與相關參數的關系，NSCLC組織中PD-L1蛋白陽性表達與患者預后的關系。對所有患者進行電話聯系，跟蹤隨訪，隨訪周期3年。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 PD-L1蛋白陽性表達率情況

90例NSCLC中PD-L1蛋白表達陽性72例為PD-L1陽性組，表達陰性18例為PD-L1陰性組。NSCLC組標本中PD-L1蛋白陽性表達率80.00%，癌旁正常組陽性表達率5.00%，NSCLC組高于癌旁正常組(χ2=63.526，P<0.05，表1，圖1)。

表1 PD-L1蛋白陽性表達率情況對比 單位：例(%)

圖1 PD-L1蛋白免疫組化染色結果(SP，100×)

2.2 NSCLC病灶組織標本中的PD-L1蛋白表達與臨床病理學因素的關系

肺癌組織學分化程度、是否發(fā)生淋巴結轉移、不同臨床分期的NSCLC患者PD-L1蛋白陽性表達率組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在不同年齡、性別、病灶直徑大小的NSCLC患者中，PD-L1蛋白陽性表達率間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表2 NSCLC病灶組織標本中的PD-L1表達與相關參數的關系 單位：例(%)

2.3 NSCLC組織中PD-L1蛋白陽性表達與患者預后的關系

所有患者得到隨訪，其中PD-L1陽性組失訪6例(8.33%)，PD-L1陰性組失訪1例(5.56%)。PD-L1蛋白陽性表達的NSCLC患者3年生存率(19.70%)顯著低于陰性患者的52.94%(P<0.05)。PD-L1蛋白陽性表達患者的中位生存時間21.0月，陰性表達患者中位生存時間28.0月，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(Log Rank (Mantel-Cox)=6.019，P=0.014；圖2)。

圖2 NSCLC組織中PD-L1蛋白表達與患者遠期預后關系函數圖

2.4 多因素分析結果

以患者的3年生存率作為因變量，TNM分期、分化程度、淋巴結轉移、PD-L1蛋白表達作為自變量，采用非條件Logistic回歸分析，結果顯示：TNM分期增高、發(fā)生淋巴結轉移、PD-L1蛋白陽性表達是NSCLC患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05)；分化程度對NSCLC患者的預后影響不明顯(P>0.05，表3)。

表3 多因素分析結果

3 討 論

肺癌屬于全球范圍內發(fā)病率和死亡率位居首位的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐年提升，在中國，空氣環(huán)境污染、工業(yè)化加速以及人口老齡化等多種因素導致肺癌的發(fā)病風險越來越高。早期肺癌病灶十分隱匿，雖然CT檢查在診斷肺癌中的地位越來越重要，但是潛在的輻射誘發(fā)癌變風險和檢查費用高昂導致部分患者無法接受，而其他諸如超聲內鏡引導支氣管黏膜活檢術等診斷方式的準確性較高，但操作復雜，無法在臨床普及，因此多數肺癌患者就診時已處于晚期，失去了最佳的手術時機[3-4]。另一方面，目前采取全身化療方法雖然可以適度延長患者生存期，但是傳統(tǒng)的細胞毒藥物療效已經達到平臺期，腫瘤對臨床使用的化療藥物存在一定的耐藥性，而且對患者正常組織與細胞也會產生殺傷作用，需要尋求新的抗腫瘤靶點以提升患者臨床治療效果[5-6]。腫瘤細胞侵犯后集體動態(tài)平衡被打破，免疫細胞具有識別、清除非己抗原作用，然后惡性腫瘤能夠建立適應自身生長的微環(huán)境，而且建立時間段，人體免疫監(jiān)視出現漏洞，腫瘤細胞會繼續(xù)增殖并發(fā)生轉移。腫瘤的微環(huán)境一般是多種細胞、細胞外基質以及各種細胞因子構成，能夠對細胞的生長、分化、成熟、凋亡以及細胞表面相關因子的分泌、表達進行調節(jié)，這樣人體免疫系統(tǒng)可以正常發(fā)揮作用[7-9]。

本文觀察了程序性死亡配體-1(PD-L1)變化在非小細胞肺癌中的變化，該因子是I型跨膜糖蛋白，一級結構具有290個氨基酸，主要包括胞外區(qū)、疏水跨膜一級尾部胞質區(qū)既可以表達在活化T細胞、B細胞等細胞中，也可以在多種惡性腫瘤細胞表面進行表達[10-12]。研究發(fā)現PD-1/PD-L1屬于CD28/B7家族中重要負性協(xié)同刺激分子通路，這一通路激活后會促進T細胞凋亡過程，同時抑制效應性T細胞活化，因此能夠參與腫瘤細胞免疫逃逸過程[13]。此外，PD-L1同非小細胞肺癌的分期以及淋巴結轉移之間密切相關，表達程度同腫瘤的負荷與累計范圍之間關系密切，PD-1與PD-L1結合后可以促進T細胞衰竭與凋亡，腫瘤細胞可以免受免疫細胞殺傷，造成腫瘤細胞增殖加速，腫瘤負荷加重，腫瘤出現局部侵犯和遠處轉移[14-15]。有學者應用免疫組織化學法檢測了20例PC石蠟包埋組織標本中PD-1和PD-L1的蛋白表達情況發(fā)現，PD-1和PD-L1的表達在40%左右的PC患者中呈陽性，其中,吸煙類患者腫瘤組織中PD-l的陽性表達率明顯高于不吸煙患者，結果提示PD-1和PD-L1的陽性表達可能與PC的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關性，與本研究結果相似[15]。

本研究顯示PD-L1在NSCLC組織中呈現高表達，NSCLC組織中的PD-L1陽性表達與患者臨床分期、腫瘤分化程度、發(fā)生淋巴結轉移具有顯著的相關性，說明NSCLC可能利用PD-L1腫瘤抑制性通路發(fā)生免疫逃逸，此通路可能成為NSCLC治療的新靶點。采用非條件Logistic回歸分析，TNM分期增高、發(fā)生淋巴結轉移、PD-L1陽性表達是NSCLC患者不良預后的獨立危險因素，說明上述因素同非小細胞肺癌患者預后具有密切關聯性，可以作為評定患者預后的重要指標。本研究優(yōu)勢在于證實了PD-L1表達同NSCLC發(fā)生發(fā)展具有密不可分關系，有望成為治療的新靶標以及預后的獨立預測指標，但是本研究屬于回顧性分析，由于病理類型選擇以及患者數量不一致可能導致本實驗結果產生偏倚，有待進一步開展深入研究。

綜上所述，PD-L1在NSCLC組織中表達程度上調，并且與患者腫瘤發(fā)生、不良預后具有顯著的關系。