王 輝 ，鐘海旦 ，白衛(wèi)東 ，曾曉房 ，楊婉媛

（1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510550；2. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣東廣州 510225；3. 廣東佳寶集團(tuán)有限公司，廣東潮州 515638）

根據(jù)糧農(nóng)組織（FAO） 和世界衛(wèi)生組織（WHO）定義，益生菌是“用量足夠時(shí)，能給宿主帶來健康益處的活性微生物”[1]。益生菌具有維持人體腸道菌群平衡、增強(qiáng)胃腸的蠕動(dòng)、提高消化和吸收水平、促進(jìn)微量元素的吸收、加強(qiáng)抵抗力、延緩衰老及抑制腐敗微生物生長等多種功能[2]。

番茄，即西紅柿，是番茄屬的一種一年生或多年生草本植物。番茄含有人體所需的多種維生素和豐富的功能性活性物質(zhì)，具有良好的抗衰老、抗氧化、降低膽固醇、抗癌等效果，還可以起到預(yù)防乳腺癌等多種疾病的輔助作用[3]。木瓜是一種熱帶水果，在我國華南地區(qū)廣泛種植，富含蔗糖、還原糖、多種維生素及多種氨基酸、黃酮類等活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)人體免疫力、抗氧化、美容、止瀉等作用[4]。

有研究指出，果蔬汁可以作為良好的益生菌發(fā)酵基[5]，益生菌發(fā)酵果蔬汁不僅可以較好地保留果蔬的營養(yǎng)物質(zhì)，還兼具益生菌的益生保健功能。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者致力于益生菌發(fā)酵果蔬汁的研究。如Mousavi Z E，Ankolekar C，Antunes A E C，Pereira A L F 等人[5-8]將益生菌應(yīng)用于發(fā)酵石榴、蘋果、梨；李海萍[9]將乳酸菌接種至蜜柚汁進(jìn)行發(fā)酵；丘裕[10]將植物乳桿菌應(yīng)用于番茄、胡蘿卜復(fù)合蔬菜汁中發(fā)酵；徐安書等人[11]以德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌為菌種，對龍眼混合果蔬汁進(jìn)行發(fā)酵。

目前，國內(nèi)外對單一益生菌發(fā)酵單一果蔬汁或復(fù)合果蔬汁及復(fù)合益生菌發(fā)酵單一果蔬汁的研究報(bào)道較多，但對復(fù)合益生菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁研究報(bào)道較少。因此，以復(fù)合益菌為菌種，以口感和營養(yǎng)價(jià)值俱佳的番茄和木瓜為原料，研制出一款兼具番茄、木瓜風(fēng)味和乳酸發(fā)酵風(fēng)味的復(fù)合益生菌發(fā)酵飲料，以滿足人們?nèi)找嬖鲩L的消費(fèi)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄、木瓜，均為市售；雙歧桿菌（Bifidobacterium）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus Plantarum），仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院微生物室提供；MRS 肉湯、MRS培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（95.0%）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%），上海瑞永生物科技有限公司提供；鄰苯三酚、碳酸鈉等，均為分析純。

722N 型可見光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-2F 型pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品；LDZX-50KBS 型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；BG-270 型隔水式培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1FD 型潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 番茄與木瓜益生菌飲料工藝流程

①番茄→清洗→熱燙→去皮→切分→榨汁；

②木瓜→清洗→去皮→切分→熱燙→榨汁；

①+②混合果汁加入蔗糖調(diào)配→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→冷藏→成品。

1.2.2 操作要點(diǎn)

（1） 熱燙。將番茄和木瓜用90～95 ℃的水熱燙2 min。

（2） 榨汁。木瓜與水按料液比3∶1，番茄與水按料液比1.5∶1.0 分別榨汁，過濾。

1.2.3 飲料的感官評價(jià)

由15 人組成感官評價(jià)小組，對產(chǎn)品進(jìn)行感官評價(jià)，取其平均值作為感官評價(jià)結(jié)果。

感官評價(jià)見表1。

1.2.4 發(fā)酵劑的制備

（1） 菌種活化。將菌種接種至10%脫脂乳粉溶液，于37 ℃下發(fā)酵4 h，將在4 h 內(nèi)凝固的酸奶接種至已滅菌的10%脫脂乳粉溶液，傳代培養(yǎng)3～4 次，4 ℃下保存。

（2） 菌種馴化。以10%脫脂乳粉溶液與果汁按照9∶1 的配比混合后作為培養(yǎng)基，并逐步降低脫脂乳粉溶液比例至純混合果汁，接種菌種，培養(yǎng)至乳酸菌含量為1.0×107CFU/mL[12]。

表1 感官評價(jià)

1.2.5 番茄汁、木瓜汁和菌種配比的研究

（1） 番茄汁、木瓜汁配比的研究。將番茄汁與木瓜汁分別按 50 ∶50，45 ∶55，40 ∶60，35 ∶65，30∶ 70，25∶75，20∶80，15∶85 比例混合后進(jìn)行感官評價(jià)。

（2） 果汁和菌種配比的研究。在菌種添加量3%和蔗糖添加量6%條件下，將比例為25∶75，30∶70，35∶65 的番茄、木瓜汁，分別采用雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌37 ℃下發(fā)酵6 h 后，4 ℃下冷藏20 h。以感官評價(jià)為主要評價(jià)指標(biāo)，總酸為輔助指標(biāo)確定菌種搭配。

（3） 菌種比例的研究。在番茄汁與木瓜汁比例為35∶65，菌種添加量3%的條件下，分別加入比例為2∶1，1∶1，1∶2 的雙岐桿菌和植物乳桿菌于37 ℃下發(fā)酵6 h，4 ℃下冷藏20 h 后進(jìn)行感官評價(jià)和總酸含量測定。

（4） 發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)。番茄汁、木瓜汁混合比例為35∶65，雙岐桿菌與植物乳桿菌為2∶1 的條件下，固定接種量為3%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)間為6 h，考查不同蔗糖添加量（3%，4%，5%，6%，7%，8%） 對感官評價(jià)和總酸濃度的影響；固定接種量為3%，發(fā)酵溫度為37 ℃，蔗糖添加量為 6%，考查發(fā)酵時(shí)間 （4，5，6，7，8，9 h） 對感官評價(jià)和總酸濃度的影響；固定發(fā)酵溫度為37 ℃，蔗糖添加量為6%，發(fā)酵時(shí)間為6 h，考查接種量（2%，3%，4%，5%，6%，7%） 對感官評價(jià)和總酸濃度的影響；固定接種量為5%，蔗糖添加量為6%，發(fā)酵時(shí)間為6 h，考查發(fā)酵溫度（35，36，37，38，39， 40 ℃） 對感官評價(jià)和總酸濃度的影響。

1.2.6 發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.7 產(chǎn)品品質(zhì)評價(jià)

可溶性固形物含量使用阿貝折光儀直接測定；pH值使用pH 計(jì)直接測定；還原糖含量參照GB 5009.7—2016 測定；總酸含量參照GB/T 1245—2008 測定；菌落總數(shù)參照GB 4789.2—2010 測定；乳酸菌數(shù)參照GB 4789.35—2016 測定。

1.2.8 抗氧化物質(zhì)及活性的測定

黃酮含量測定，采用亞硝酸鈉- 硝酸鋁分光光度法[13]測定；總酚含量測定，采用福林酚法[14]測定；超氧化物歧化酶（SOD） 活性測定，采用鄰苯三酚法[15]測定；維C 含量測定，采用分光光度法[16]測定；羥基自由基清除率測定，采用鄰菲咯啉[17]法測定；DPPH 自由基清除率測定，根據(jù)李學(xué)鵬等人[18]的方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)測定均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。應(yīng)用SPSS 22.0 軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA） 中的One-Way ANOVA 對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進(jìn)行分析，p＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄汁、木瓜汁配比和菌種的研究

2.1.1 番茄汁、木瓜汁配比的研究

番茄汁、木瓜汁配比的影響見圖1。

圖1 番茄汁、木瓜汁配比的影響

由圖1 可知，當(dāng)番茄汁與木瓜汁配比為35∶65，30∶70，25∶75 時(shí)，感官評分較高。番茄汁添加量過多時(shí)，上清液析出、口感偏酸；木瓜汁添加量過多時(shí)，木瓜味過于厚重，果汁過于濃稠，感官評分均較低。因此，選取35∶65，30∶70，25∶75 這3 個(gè)配比進(jìn)行果汁、菌種搭配試驗(yàn)。

2.1.2 番茄汁、木瓜汁與菌種配比的研究

番茄汁、木瓜汁與菌種配比的影響見表3。

由表3 可知，混菌發(fā)酵的各項(xiàng)指標(biāo)明顯高于單一菌種（p＜0.05）；混合菌種中，雙歧桿菌與植物乳桿菌混合菌種產(chǎn)品的總酸和感官評分最高（p＜0.05）；番茄汁與木瓜汁配比為35∶65 時(shí)，總酸濃度和感官評分都較高。分析原因可能是由于單菌發(fā)酵產(chǎn)物較單一，而混合乳酸發(fā)酵多為異型乳酸發(fā)酵，反應(yīng)產(chǎn)物較為豐富, 口感風(fēng)味更佳[19]。因此，選取雙歧桿菌和植物乳桿菌混合菌種作為發(fā)酵菌種，番茄汁與木瓜汁配比確定為35∶65。

表3 番茄汁、木瓜汁與菌種配比的影響

2.1.3 復(fù)合益生菌菌種配比的影響

菌種配比的影響見圖2。

由圖2 可知，當(dāng)植物乳桿菌配比增加時(shí)，總酸逐漸降低。分析原因可能是雙歧桿菌和植物乳桿菌都是高產(chǎn)酸菌株，但與雙歧桿菌相比，植物乳桿菌產(chǎn)酸能力更強(qiáng)[20-21]。當(dāng)雙歧桿菌與植物乳桿菌配比為2∶1 時(shí)，產(chǎn)品的感官評分與總酸濃度均最高。因此，雙歧桿菌與植物乳桿菌配比為2∶1 是最佳配比。

圖2 菌種配比的影響

2.2 復(fù)合益生菌發(fā)酵番茄汁、木瓜汁工藝的優(yōu)化

2.2.1 蔗糖添加量的影響

蔗糖添加量的影響見圖3。

圖3 蔗糖添加量的影響

由圖3 可知，感官評分和總酸濃度均隨蔗糖添加量增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)蔗糖添加量為2%～6%時(shí)，感官評分隨蔗糖添加量增加而逐漸上升；當(dāng)蔗糖添加量為7%時(shí)，因?yàn)榘l(fā)酵不充分，甜度過高，感官評分降低；蔗糖添加量為6%時(shí)，感官評分最高；當(dāng)蔗糖添加量為4%時(shí)，總酸濃度最高。蔗糖添加量大于或小于4%時(shí)，總酸濃度偏低。原因是當(dāng)蔗糖添加量較小時(shí)，總酸濃度比較低，碳源不足；蔗糖添加量過大時(shí)，微生物受到較高滲透壓的影響，生長代謝受到抑制，均導(dǎo)致發(fā)酵不充分。以感官評價(jià)為主要評價(jià)指標(biāo)，總酸為輔助指標(biāo)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選擇蔗糖添加量4%，5%，6%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間的影響

發(fā)酵時(shí)間的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間的影響

由圖4 可知，總酸濃度隨發(fā)酵時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，感官評分隨發(fā)酵時(shí)間增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。發(fā)酵時(shí)間為6 h 時(shí)，感官評分最高，可能是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間不足6 h 時(shí)，產(chǎn)品發(fā)酵不完全，導(dǎo)致香味和滋味不夠濃郁；發(fā)酵時(shí)間超過6 h時(shí)，總酸濃度過高，導(dǎo)致產(chǎn)品酸味明顯增加，感官評分降低。因此，選取發(fā)酵時(shí)間5，6，7 h 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3 接種量的影響

接種量的影響見圖5。

圖5 接種量的影響

由圖5 可知，隨著接種量的增加，感官評分先增加后減少，總酸濃度先升高后趨于逐漸穩(wěn)定。接種量小于5%時(shí)，接種量越大，益生菌利用發(fā)酸底物產(chǎn)酸速度越快，產(chǎn)酸量越大；接種量達(dá)5%后，乳酸菌已充分利用發(fā)酵底物產(chǎn)酸，增加接種量對產(chǎn)酸影響變小。接種量為5%時(shí)，產(chǎn)品感官評分最高，總酸為2.32 mol/L；接種量大于5%時(shí)，感官評分顯著降低。因此，選擇接種量3%，4%，5%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.4 發(fā)酵溫度的影響

發(fā)酵溫度的影響見圖6。

圖6 發(fā)酵溫度的影響

由圖6 可知，總酸濃度隨發(fā)酵溫度升高呈現(xiàn)先升高后穩(wěn)定的趨勢，感官評分呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。菌種的生長，發(fā)酵產(chǎn)酸，風(fēng)味物質(zhì)的形成都有不同的最適溫度，過低和過高溫度對菌種發(fā)酵產(chǎn)酸和發(fā)酵液的風(fēng)味和口感會(huì)產(chǎn)生影響。發(fā)酵溫度過低時(shí)，菌種的生長和繁殖速度較慢，果汁未充分發(fā)酵，產(chǎn)酸和風(fēng)味物質(zhì)均不足；發(fā)酵溫度過高時(shí)，發(fā)酵速度高，但產(chǎn)生的風(fēng)味不佳。當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品感官評分和總酸濃度最高。因此，選擇發(fā)酵溫度37，38，39 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4 可知，最優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A2B3C1D2，即蔗糖添加量6%，菌種接種量5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 h。經(jīng)檢測，該工藝條件下發(fā)酵的番茄汁、木瓜汁益生菌飲料的pH 值為3.73，總酸濃度為 2.3 mol/L，菌落總數(shù)為7.1×103CFU/mL，乳酸菌數(shù)為 5.7×108CFU/mL，均符合 T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素規(guī)定》[22]，且酸甜適中，組織狀態(tài)均勻，具有果蔬特有風(fēng)味。

2.3 發(fā)酵前后果汁抗氧化物質(zhì)及活性的變化

表4 發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

果汁抗氧化質(zhì)物及活性的變化見表5。

表5 果汁抗氧化質(zhì)物及活性的變化

由表5 可知，發(fā)酵后，番茄、木瓜益生菌飲料中的SOD 酶活性、總酚含量、黃酮含量均顯著提高（p＜0.05），分別比發(fā)酵前增加了28.28%，21.50%，33.01%。但維C 含量由發(fā)酵前的43.77 μg/mL 降至發(fā)酵后的30.79 μg/mL?？赡苁且?yàn)榫SC 不穩(wěn)定，在發(fā)酵過程中極易被氧化和維C 在發(fā)酵過程中被乳酸菌作為碳源所利用[23]。同時(shí)，發(fā)酵后對羥基自由基和DPPH 自由基的清除率均顯著提高（p＜0.05），DPPH自由基清除率達(dá)到了93.49%?？赡苁侨樗峋l(fā)酵后產(chǎn)生一些糖苷酶去除基化酚類化合物，使抗氧化性增強(qiáng)[24-26]；還可能產(chǎn)品本身含有的多酚、維C、SOD等起到一定的協(xié)同作用，從而使產(chǎn)品在發(fā)酵后抗氧化性顯著增強(qiáng)。

3 結(jié)論

（1） 以番茄和木瓜為原料，確定了復(fù)配果汁接種復(fù)合益生菌菌種的最佳發(fā)酵工藝為番茄汁、木瓜汁混合配比35∶65，雙歧桿菌和植物乳桿菌混合配比2∶1，接種量5%，蔗糖添加量6%，發(fā)酵溫度37 ℃。按照該工藝所制得的番茄、木瓜益生菌飲料為橙色，色澤明亮、酸甜適中，具有果蔬特有風(fēng)味。其可溶性固形物、還原糖含量、pH 值、總酸、菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)均符合T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素規(guī)定》。

（2） 與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后番茄、木瓜益生菌飲料中的SOD 酶活性、總酚和黃酮的含量分別提高28.28%，21.50%和33.01%，維C 含量降低29.70%；同時(shí)，抗氧化能力較大程度提高，羥基自由基清除率提高41.50%，DPPH 自由基清除率提高11.35%。