范鵬飛,顧春華,楊陶麗薇,郭嬌嬌,楊雅珺

摘? 要：目的? 通過參加中日聯(lián)合微生物檢測(cè)技能考核（2021年第1回合）項(xiàng)目金黃色葡萄球菌（定量）檢驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)室競爭力，比較分析顯色平板與Baird-Parker平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的差異性。方法? 采用GB4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》，同時(shí)采用顯色平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)可疑菌落采用全自動(dòng)微生物菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。結(jié)果? 樣品21-Q669用Baird-Parker平板計(jì)數(shù)結(jié)果為20000 CFU/mL，顯色平板計(jì)數(shù)結(jié)果為19000 CFU/ mL，經(jīng)Duncan法單因素方差分析，差異不顯著（P>0.05），反饋結(jié)果為滿意。結(jié)論? 顯色平板在能力驗(yàn)證中可以進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，通過參加技能考核，提升了實(shí)驗(yàn)室競爭力，可以為能力驗(yàn)證活動(dòng)及食品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌; 能力驗(yàn)證; 平板計(jì)數(shù); 比較分析

中圖分類號(hào)：O651

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），革蘭氏染色為陽性菌，在顯微鏡下呈葡萄串狀，是一種常見的食源性致病微生物。金黃色葡萄球菌無鞭毛、芽胞，少部分有莢膜，不能運(yùn)動(dòng)，為需氧或兼性厭氧菌，最適宜的生長溫度為 37 ℃，pH 值為 7.4[1]。在葡萄球菌屬的 20 多個(gè)種中，金黃色葡萄球菌是最嚴(yán)重的致病菌[2]。致病原因?yàn)榉置诘亩舅睾颓忠u性酶而引起食物中毒，如殺白細(xì)胞素、腸毒素、溶血毒素、血漿凝固酶和脫氧核糖核酸酶[3-4]?？蓪?dǎo)致人皮膚感染、敗血病、中毒性休克、心內(nèi)膜炎等[5] 。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在世界范圍內(nèi)，與金黃色葡萄球菌相關(guān)的感染特別是那些表達(dá)多藥耐藥性的感染在逐年增加[6]。

金黃色葡萄球菌鑒定主要有免疫學(xué)方法，包括免疫凝聚和沉淀法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法[7]等;分子生物學(xué)方法包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[8]、多重PCR技術(shù)[9]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[10]、數(shù)字PCR系統(tǒng)等[11]。這些方法由于其設(shè)備昂貴，操作人員水平要求高，對(duì)于普通實(shí)驗(yàn)室難以達(dá)到。所以常規(guī)平板培養(yǎng)法是食品檢驗(yàn)中主要的檢測(cè)方法，但比較耗時(shí)，一般要經(jīng)過培養(yǎng)增菌、劃線純化、形態(tài)觀察、生化鑒定、血清分型等，鑒定結(jié)果至少2～7天。金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)國標(biāo)（GB4789.10-2016）方法中采用Baird-Parker平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，該平板是一種選擇性培養(yǎng)基，在含有氮源的基礎(chǔ)上，加入了促生長的丙酮酸鈉和抑制劑亞碲酸鉀，故有較好的選擇性，但對(duì)于金黃色葡萄球菌沒有抑制，能將亞碲酸鉀還原為碲在菌落中心呈黑色，易于觀察。加入卵黃，由于卵磷酯酶陽性特征，其菌落周圍可出現(xiàn)明顯的沉淀環(huán)，可與其它菌進(jìn)行區(qū)別。顯色培養(yǎng)基目前發(fā)展的較為成熟，該原理是利用目的菌的特征代謝物與培養(yǎng)基中的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而使菌落顯現(xiàn)特有顏色，達(dá)到與雜菌分離的方法，目前顯色培養(yǎng)基在食品檢驗(yàn)中已廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)采用了Baird-Parker瓊脂平板與金黃色葡萄球菌顯色平板分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，比較顯色平板與Baird-Parker平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的差異性，可以為食品中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)能力驗(yàn)證和日常檢驗(yàn)提供參考。

1? 材料及方法

1.1? 材料與試劑

樣品21-Q669（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心發(fā)放）;金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（法國科馬嘉公司）; Baird-Parker瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染液、血平板、凍干兔血漿、L型涂布棒（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）;NID鑒定板（美國BD公司）;金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538（廣東微生物研究所）;表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC（B）26069（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2? 儀器與設(shè)備

IPP260plus生化培養(yǎng)箱（美國墨爾特公司）;CL-32L高壓滅菌器（日本ALP公司）;AC2-5S1生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司）; Phoenix M50全自動(dòng)菌種鑒定儀（美國BD公司）; BX53顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社公司）;sensor turn培養(yǎng)皿自動(dòng)轉(zhuǎn)盤（德國wld-tec公司）;levo plus電動(dòng)移液器（北京大龍興創(chuàng)公司）;Votex 2渦旋振蕩器（德國IKA公司）。

1.3? 方法

1.3.1? 樣品的復(fù)原

用酒精棉球消毒西林瓶外部，小心打開瓶蓋，立即加入20 mL生理鹽水進(jìn)行水化，充分溶解后吸出放入無菌瓶中，用剩余的生理鹽水清洗西林瓶內(nèi)部，回收清洗液放入上述無菌瓶中，總共60 mL，此溶液即為復(fù)原后60 mL的食品樣品。

1.3.2? 平板計(jì)數(shù)

用1 mL無菌移液管吸取樣品原液，加入9 mL生理鹽水管中，制成1∶10（濃度）的樣品勻液，吸取1∶10的樣品勻液1 mL，加入加入9 mL生理鹽水管中，制成1∶100的樣品勻液，以此類推，制成10倍系列的稀釋液。每個(gè)稀釋度的稀釋液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別加入三個(gè)Baird-Parker平板和三個(gè)顯色平板，用L型涂布棒涂抹均勻，直至平板表面樣液完全吸收，每個(gè)稀釋度兩個(gè)平行。倒置后于36 ℃培養(yǎng)24 h。金黃色葡萄球菌在BP平板上為灰黑色或黑色、表面光滑、濕潤、凸起的圓形菌落，周圍有不透明沉淀圈，其外常有一清晰帶，在顯色平板上呈紫紅色、紅色、粉紅色，其它菌呈藍(lán)色、無色或抑制生長。

1.3.3? 確證鑒定

（1）血平板

挑取BP平板和顯色平板上各10個(gè)典型的菌落，劃線接種于血平板，倒置后于36 ℃培養(yǎng)24 h。在血平板上金黃色葡萄球菌菌落較大，呈黃色或白色、凸起、濕潤的圓形菌落，周圍有完全透明溶血圈。同時(shí)血平板上劃線接種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，表皮葡萄球菌在血平板上呈濕潤、凸起、白色的圓形菌落，周圍無透明溶血圈。

（2）染色鏡檢

對(duì)血平板上典型的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在100倍油鏡下觀察，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，無芽胞，呈葡萄球狀排列，直徑約為0.5～1.0 μm。表皮葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，直徑1.0μm左右，成葡萄狀排列。

（3）血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

將血平板上典型的菌落接種到5 mL 腦心浸出液肉湯管中，36 ℃培養(yǎng)24 h。取0.3 mL BHI培養(yǎng)物加入兔血漿中，，置36 ℃培養(yǎng)箱中，每半小時(shí)觀察一次，觀察6 h。同時(shí)以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽性對(duì)照，以表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作陰性對(duì)照。

1.3.4? 生理生化鑒定

經(jīng)確證后的菌落，劃線于營養(yǎng)瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)24 h后采用全自動(dòng)微生物菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，用接種環(huán)挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落到4.5 mL的Phoenix ID肉湯管中，制成0.5 McFarland的菌懸液，倒入NID卡后封蓋，放入BD機(jī)箱中進(jìn)行鑒定。

1.3.5? 結(jié)果計(jì)算

按照GB4789.10-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中的計(jì)算公式和規(guī)則進(jìn)行計(jì)算。

1.3.6? 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件，對(duì)不同平板計(jì)數(shù)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan法單因素方差分析（P<0.05）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)

經(jīng)Baird-Parker平板與顯色平板分離，樣品中的菌落與金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌菌落形態(tài)基本一致（見表1），但樣品中的疑似金黃色葡萄球菌菌落顏色在Baird-Parker平板上呈灰黑色，而金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌在Baird-Parker平板呈黑色。長期貯存的脫水或冷凍食品中的金黃色葡萄球菌，其菌落顏色較典型菌落淺些，有時(shí)可見到?jīng)]有不透明圈和清晰帶的金黃色葡萄球菌，這種菌的其他外觀與典型的金黃色葡萄球菌基本相同，在選取疑似菌時(shí)，除典型菌落之外，還應(yīng)對(duì)其它有差異的菌落進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，避免漏掉一些特殊的菌落。

2.2? 確證實(shí)驗(yàn)

對(duì)Baird-Parker平板和顯色平板中的疑似菌落進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)（見表2），對(duì)第二稀釋度平板上的疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、血平板劃線和血漿凝固酶試驗(yàn)，挑取的20個(gè)菌落革蘭氏染色鏡檢均為陽性球菌，40個(gè)疑似菌落劃線血平板后均有溶血圈，40個(gè)菌落進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)均為陽性。利用微生物全自動(dòng)菌種鑒定系統(tǒng)對(duì)較小菌落、較大菌落、黑色菌落、灰黑色菌落和沉淀圈不明顯的菌落進(jìn)行鑒定，其鑒定結(jié)果均為金黃色葡萄球菌（見表3），置信度均在97 %以上，為極好的鑒定。

2.3? 平板計(jì)數(shù)

樣品平板涂布后計(jì)數(shù)的原始數(shù)據(jù)見表4，樣品原液和第一稀釋度菌落多不可計(jì)，第二稀釋度和第三稀釋度平板上涂布均勻，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB4789.10-2016中的計(jì)算公式，Baird-Parker平板中平行1和顯色平板中平行1和平行2的數(shù)值用公式1計(jì)算，Baird-Parker平板中平行2的值用公式2計(jì)算，其結(jié)果見表5。

2.4? 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)國標(biāo)GB4789.10-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》，選取菌落數(shù)在20～200之間的平板計(jì)算菌落數(shù)，即第二稀釋度和第三稀釋度的值符合要求。對(duì)兩種培養(yǎng)基第二稀釋度的菌落數(shù)進(jìn)行Duncan法單因素方差分析，F(xiàn) = 4.235，P = 0.176，差異不顯著（P > 0.05），結(jié)果見表6。對(duì)兩種培養(yǎng)基第三稀釋度的菌落數(shù)進(jìn)行Duncan法單因素方差分析，F(xiàn) = 1.000，P = 0.423，差異不顯著（P > 0.05），結(jié)果見表 7。用兩種培養(yǎng)基最終計(jì)算結(jié)果進(jìn)行Duncan法單因素方差分析，F(xiàn) = 2.000，P = 0.293，差異不顯著（P > 0.05），結(jié)果見表 8。由此可見，金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)中，使用顯色培養(yǎng)基和Baird-Parker培養(yǎng)基分別計(jì)數(shù)，其結(jié)果差異不顯著，顯色培養(yǎng)基可以在金黃色葡萄球菌定量能力驗(yàn)證中計(jì)數(shù)。

3? 結(jié)論與討論

樣品21-Q669用Baird-Parker平板計(jì)數(shù)結(jié)果為20000 CFU/mL顯色平板計(jì)數(shù)結(jié)果為19000 CFU/mL，最終所報(bào)的值采用了Baird-Parker平板計(jì)數(shù)結(jié)果，反饋值為Z = 0.00（|Z| ≤ 2為滿意結(jié)果，2.0<|Z |<3.0為可疑結(jié)果，|Z| ≥ 3.0為不滿意結(jié)果。），評(píng)價(jià)結(jié)果為滿意。若采用顯色平板計(jì)數(shù)結(jié)果，其值也在通報(bào)數(shù)值范圍內(nèi)（13000～32000 CFU/mL）。在檢驗(yàn)過程中需要注意的是，使用鑒定合格的移液槍，培養(yǎng)基均應(yīng)驗(yàn)收合格，涂布同一稀釋度平板應(yīng)使用同一涂布棒，以減少誤差，使結(jié)果更準(zhǔn)確。對(duì)兩種培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果，分別選取了第二稀釋度和第三稀釋度平板上計(jì)數(shù)的值，以及兩種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)后最終計(jì)算結(jié)果進(jìn)行了Duncan法單因素方差分析，分析表明，顯色培養(yǎng)基和Baird-Parker瓊脂計(jì)數(shù)結(jié)果差異不顯著（P > 0.05），顯色培養(yǎng)基在能力驗(yàn)證中可以用作金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)。由于顯色培養(yǎng)基可以區(qū)分出雜菌，排除干擾菌，在計(jì)數(shù)時(shí)更直觀明了，節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間，尤其在能力驗(yàn)證中，采用不同的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，可以相互驗(yàn)證和比較，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

金黃色葡萄球菌遍布于自然界，很多食品容易被污染，在食品致病菌檢驗(yàn)中為重要的檢測(cè)項(xiàng)目，其中乳制品、水果干制品、肉類、糕點(diǎn)等較容易檢出[12]。引起污染的原因主要為原料帶菌、生產(chǎn)過程滅菌不徹底、生產(chǎn)人員污染等。目前金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)主要采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法[13-14]，食品中以GB4789.10-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》為依據(jù)。目前，顯色培養(yǎng)基在多個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)中被應(yīng)用，比如GB4789.4-2016、GB4789.5-2012、GB4789.7-2013等方法中均采用了顯色培養(yǎng)基，但食品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)的國家標(biāo)準(zhǔn)中只采用了Baird-Parker瓊脂。顯色培養(yǎng)基發(fā)展已經(jīng)較為成熟，比如法國科瑪嘉公司和北京陸橋公司等生產(chǎn)的顯色培養(yǎng)基靈敏度高、質(zhì)量穩(wěn)定、易觀察，幫助檢驗(yàn)人員節(jié)約了大量的檢驗(yàn)時(shí)間，提高了檢出率。在日常檢驗(yàn)以及能力驗(yàn)證中，顯色培養(yǎng)基可以作為不同的方法進(jìn)行檢測(cè)，利用顯色培養(yǎng)基檢測(cè)金黃色葡萄球菌，較傳統(tǒng)的 Baird - Parker 更易于區(qū)分雜菌，具有較好的檢測(cè)效果，有良好的應(yīng)用前景[15]。

參考文獻(xiàn)

[1] 張超楠. 食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法研究[D].吉林大學(xué)，2012.

[2] 張濤濤，王蘭，龔頻，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（2）：238-241.

[3] 高 路，何聰芬，李 萌，張昕悅等. 金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，32（02）：51-55+71.

[4] 陳瑤，劉張玲，湯榮睿. 金黃色葡萄球菌生物膜預(yù)防和治療的研究進(jìn)展[J]. 中國抗生素雜志， 2021，46（01）：20-26.

[5] Zhou QianJin， Lu JianFei， Su XiuRong， et al. Simultaneous detection of multiple bacterial and viral aquatic pathogens using a fluorogenic loop-mediated isothermal amplification-based dual-sample microfluidic chip [J]. Journal of Fish Diseases， 2020，

[6] Soltani Malihe， Hajikhani Bahareh， Zamani Samira， et al. Molecular characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from hospitalized patients based on coagulase gene polymorphism analysis： High frequency of vancomycin-intermediate S. aureus and the emergence of coagulase type II in Iran[J]. Gene Reports， 2021， 23

[7] Hu Yaozhong， Sun Ying， Gu Jiaxin， et al. Selection of specific nanobodies to develop an immuno-assay detecting Staphylococcus aureus in milk[J]. Food Chemistry， 2021， 353

[8] 蘇明權(quán)，楊柳，馬越云，等. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法的試驗(yàn)研究[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010（ 8） ： 794-796.

[9] Li Peng， Zhang Dingxiu， Li Hongmei， et al. Establishment and Application of Multiplex PCR for Simultaneously Detecting Escherichia coli， Salmonella， Klebsiella pneumoniae， and Staphylococcus aureus in Minks [J]. Frontiers in Veterinary Science， 2020，

[10] HongYang，XiaoyanMa，XianzhouZhang，WeiZhang.? Development and Evaluation of a Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for the Rapid Detection of Staphylococcus aureus in Food [J]. European Food Research and Technology. 2001，232（5）：769-776.

[11] [Zhang Tiantian， Niu Zhiqiang， Wu Feng， et al. Qualitative and quantitative detection of surgical pathogenic microorganisms Escherichia coli and Staphylococcus aureus based on ddPCR system [J]. Scientific Reports， 2021， 11（1）

[12] 徐文文，梁玉林，王云霞，劉秀，尹建軍，周廣軍，宋全厚，丁夢(mèng)璇，周鵬飛. 二重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)乳粉中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2021，47（02）：241-246.

[13] 中華人民共和國衛(wèi)生部.化妝品衛(wèi)生規(guī)范[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007： 271-273.

[14] 陳丙卿，王茂起.現(xiàn)代食品衛(wèi)生學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001： 757-758.

[15] 蔡芷荷，盧勉飛，滕昆侖，時(shí)威，吳清平，梁家豪.金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基檢測(cè)效果評(píng)價(jià)[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，0（6）